환경유전자 (environmental DNA, eDNA)는 생태학과 환 경관리에 떠오르는 중요한 도구가 되고 있다. 최근 10여 년 에 걸쳐 차세대 염기서열분석 (next-generation sequencers, NGS)의 급격한 발달로 연구자들의 관심과 다양성 연구 및 희귀종 탐색의 접근론적 방법으로 고려가 집중되고 있다. 2019년 젊은 수생태 연구자들이 모여, eDNA연구회를 만들 어 연구 교류가 시작되었고, 2020년 한국생태환경과학협의 회 학술발표대회 주제로 “차세대 생태환경과학 연구를 위 한 첨단기법”에서 eDNA 기술의 활용과 적용을 알렸으며, 이 후 2021년 7월 생태학 및 분류학을 기반으로 eDNA 연구에 관심을 가진 연구자들이 모여 한국환경유전자학회 (Korean Society of Environmental DNA: KSED)를 창립하였다. 다 양한 환경 매체를 다루는 연구자들이 시료 채집과 처리방법, 데이터 처리 기술과 현안 문제들을 공유하고 해결할 수 있는 플랫폼으로서의 역할을 KSED가 할 수 있기를 기대한다. 현 재, 시료로부터 유전자 추출과 시컨싱 기술은 많은 발전을 이 루어져 있으며, eDNA에 적용되는 기본 기술은 동일하고 시 컨싱으로 얻어진 생물 데이터의 신뢰성과 정확성을 보장받 기 위한 강력한 데이터베이스의 축적과 파이프라인이 구축 되어야 하는 필요성이 있으며, 또한 이는 국내 실정에 맞는 국제적인 틀을 기반으로 이루어져야 한다. 환경유전자에 많 은 관심을 가지고 역할과 기능을 만들어 참여하실 수 있도록, 유연한 조직을 갖추어 연구 실무진에 속하는 미래 학문 후 속세대인 젊은 연구자와 대학원생들이 참여하는 운영진으로 구성하고자 하였으며, 원하는 연구자들이라면 누구나 참여할 수 있도록 하였다. 앞으로 많은 연구자들이 협력하고 연구를 진행할 수 있는 연구 플랫폼으로 성장하리라 기대한다.

본 총설에서는 환경유전자의 용어 정의와 연구가 이루어 진 진행과정을 살펴보고자 한다. 미생물 분야의 eDNA 연구 는 first NGS (next-generation sequencers) 시대인 2005년 이전에는 새로운 sequence의 발생과 분석에 필요한 추가 연 구의 고비용 문제로 연구가 매우 소수 이루어졌다. 또한 다 양한 생물이 복합 혼합되어 있는 DNA의 경우에는 분해되어 진 상태나 낮은 농도로 신선한 단일 생물의 조직으로부터 추 출하고 분석하는 것보다 어려움이 많아 쉽지 않았다. 그리고 eDNA 분석은 전통적인 생태학, 바이오인포메틱스, 분자생물 학적인 기술에 대한 지식을 필요하기에 분야 간의 이해가 이 루어져야 한다는 점에서는 어려움이 있다.

먼저, 환경유전자 (environmental DNA, eDNA)란 환경으 로부터 수집된 시료에 포함되어져 있는 많은 생물로부터 추 출된 염색체로 이루어진 genomic DNA의 복합체라고 정의 되기도 하였다 (Taberlet et al., 2012). 현재는 물, 눈, 흙, 퇴적 물, 공기 등 다양한 환경에 잔존하는 DNA 복합체로 생물 유 래의 DNA를 총칭하는 의미로 확장되어 사용되고 있다. 또한 DNA 기반의 분류학적 또는 기능적인 정보 분석으로 생태계 를 이해하기 위한 목적으로 사용하기 위한 시도도 이루어지 고 있다. 총 DNA는 세포 내와 세포 외의 DNA 둘 다 포함한 것이다 (Levy-Booth et al., 2007). 세포 내 DNA는 살아있는 세포 또는 환경 시료로부터 얻어진 살아있는 다양한 생물유 기체로부터 추출한 것이고, 세포 외 DNA는 죽은 세포 또는 파괴된 세포로 물리적, 화학적, 생물학적 과정을 거쳐 분해 되고 있는 상태로 구분할 수 있다. DNA 분자는 뉴클레아제 (nucleases)의 작용으로 작은 절편으로 잘라지고, 이 절편들 은 진흙, 모래, 점토 그리고 촉촉한 기질의 표면에 부착되어 진 상태의 세포 외 eDNA로 존재하게 될 것이다.

eDNA 시료에서 분류군을 확인하고 싶다면, PCR (Polymerase Chain Reaction)을 기반으로 2가지 접근법 을 고려할 수 있는데, 1) 단일종 (single species)의 존재 유 무 파악을 목표로 할 경우, 종 특이적 정량적인 PCR 분석방 법 (Logan et al., 2009)과 2) target PCR (Saiki et al., 1988, White et al., 1989)이나 shotgun sequencing (산탄 염기서열 결정법: Deininger, 1983)으로 고도로 잘 보존된 짧은 염기 서열을 이용하여 잠재 가능한 모든 종을 제시하는 방법이 있 는데, 보통 두 번째 방법을 “DNA metabarcoding”이라고 한 다. “DNA metabarcoding”은 동일한 eDNA 샘플 내에서 많 은 분류군을 동시에 식별할 수 있는 방식의 DNA 바코딩하 는 기술이다 (Pompanon et al., 2011;Riaz et al., 2011). 바코 드는 잘 보존된 비교적 짧은 분류학적인 정보가 담긴 유전자 를 이용하여 프라이머를 제작하고 PCR를 진행할 수 있게 되 는데, 주로 단일 종을 파악하기 위해 DNA 추출, PCR 증폭, 시퀀싱, 데이터 분석의 단계이다. 반면에, 메타바코드는 바 코드와 동일하게 DNA 추출, 증폭, 시컨싱, 분석을 거치지만, shotgun sequencing을 수행하여 동일 샘플에서 광범위하게 얻은 짧은 염기서열로 분류학적인 동정을 파악하게 됨으로 정확한 종 동정을 위한 데이터베이스 또는 파이프라인을 사 용하는 방식이다. “metagenomics”라는 용어가 사용되기도 하지만 genome의 기능적인 측면과 조합을 다루게 될 때 적 절하다는 의견이 있으며, shotgun sequencing와 16S rDNA 의 분류학적 동정에 주로 사용하고 있는 방법이다 (Tringe et al., 2005). “metatranscriptomics”은 환경시료로부터 RNA 을 추출하여, 그 시점의 유전자 발현 (gene expression)과 조 절 (regulation)을 연구하는 방법으로 분석 대상 시료의 분 류학적 기능적 요인을 분석하는 데, mRNA의 반감기는 매 우 짧아 유전자 발현을 측정하는 데 극복할 문제들이 있으 며, 총 RNA는 주로 rRNA이기에 기능적 정보를 직접적으로 해석하기 어려운 한계를 해결하기 위한 연구가 진행 중이다 (Selinger et al., 2003).

eDNA 연구의 발전에 대해 살펴보면, Fig. 1과 같이 간 략하게 소개되어졌는데, Ogram 등에 의해 1987년 퇴적물 에서 eDNA를 추출하는 프로토콜이 보고되었고, 그 후 불 과 3년만에 획기적인 DNA metabarcoding이 소개되었다 (Giovannoni et al., 1990). Sargasso Sea에서 조사된 박 테리아플랑크톤 16S rRNA 유전자의 다양성을 보여주었 다 (Ogram et al., 1987). Handelsman은 1998년 불특정 미생물 내 활성 분자의 합성 경로를 규명하기 위해 토양 eDNA의 시컨싱 서열을 무작위로 잘게 자르고 클로닝하는 metagenomics를 처음으로 시도하였다. 2000년대는 DNA metabarcoding과 metagenomics가 미생물학 분야에서 보편 성을 갖추게 되었고, 2003년에는 연구대상 생물의 범위가 넓 어져서 동굴 퇴적물로부터 추출된 DNA를 이용하여 크기가 큰 맘모스, 말 그리고 고식물 연구에 DNA metabarcoding을 적용하였다 (Willerslev et al., 2003). 처음의 metabarcoding 과 metagenomics는 단일 DNA 절편을 분리하고 클로닝하 는 기술에 의존하였는데, 이를 진행하기 기반 기술은 분리 복제된 DNA 절편을 클론 벡터 (플라스미드, 박테리오파아 지 등)에 주입하고, 주입시킬 수 있는 적합한 숙주세포 (주로, Escherichia coli)가 필요하였다. 이 방법은 클로닝 단계의 많 은 비용과 시간 소모가 들어가게 되었고, 이를 개선하여 불 필요한 클로닝 단계를 획기적으로 줄여준 기술이 2005년 이 후에 사용된 NGS다. 2000년대 후반부터 DNA 메타바코딩 은 미생물의 범위를 벗어나 대형생물로 확장되었고, 연구대 상도 다양해지면서, 분변을 이용한 먹이원을 분석하는 시도 가 있었다 (Daegle et al., 2010;Pompanon et al., 2012). 이후 환경유전자의 연구는 물과 토양 (Ficetola et al., 2008), 담수 의 대형생물 (Dejean et al., 2012)로 연구 논문들이 보고되었 고, 메타바코딩을 적용하여 많은 분류군의 동정에 사용되었 다 (Thomsen et al., 2012; Valentini et al., 2016). 현재, 환경 유전자 연구는 다양한 분류군 연구에 쉽게 적용되어지는 장 점으로 연구가 급격히 늘어나고 있으나 주로 기술적인 방법 의 개선과 바이오인포메틱스에 의존하는 수준으로 진행되고 있다.

환경유전자 연구를 위해 연구자가 접근할 방법을 선택하 기 전에 파악할 흐름도는 Fig. 2에 개요적으로 담겨져 있는 데, 크게 3가지 접근법으로 정리할 수 있다. 1) 종 특이 DNA 를 이용한 targeting single species를 대상으로 접근하는 연 구는 이미 알려진 분류군 연구에 적용되고 있다 (Ficetola et al., 2008;Thomsen et al., 2012). 2) PCR 분석을 기반으 로 하여, 대상 분류군에 포함된 모든 분류군을 탐색하는 것 (group specific primers)을 목적으로 하는 “메타바코딩”을 사용하는 방법으로, 박테리아, 균류, 식물, 진행생물, 지렁이, 물고기 등을 대상으로 작용이 되었다. 3) 메타제노믹스로 특 정 targeting PCR이 없이 eDNA의 shotgun sequencing을 진 행하는 방식으로, 게놈의 기능적 연구, 주로 미생물에 적용되 고 있다 (Simon and Daniel, 2011).

바이오 기술의 환경유전자로의 적용이 진행되면서, 단 일 종의 존재 유무 파악을 위한 연구 방법으로 Taq-man probe 및 SYBR green을 이용한 quantitative PCR (qPCR) 과 digital droplet PCR (ddPCR)을 중심으로 연구가 활발하 게 진행되고 있다 (Dejean et al., 2011; Davy et al., 2015; Carlsson et al., 2017; Currier et al., 2017). 또한, 최근에 는 CRISPR-Cas 기술을 이용하여 타겟 종을 확인하는 연구 가 제안되는 등 기술적으로 다양한 방법이 진행되고 있다 (Williams et al., 2019). 다양한 환경 샘플 (물, 퇴적물, 토양, 배설물 등)에 존재하는 eDNA는 상업적으로 판매하는 키트 (DNeasy Powerwater kit, DNeasy Powersoil kit, DNeasy Blood & Tissue kit 등)와 매뉴얼 방법 (high salt, CTAB 등) 으로 DNA 추출방법이 소개되고 있으나, 환경유전자 연구 에 처음으로 접근하는 사용자들은 제품화된 키트를 이용하 는 경우가 대다수이다 (Lear et al., 2017). 성공적으로 추출 된 eDNA는 분석 목적에 맞추어 12S rRNA, 16S rRNA, 18S rRNA와 COI (Cytochrome oxidase subunit I)과 같이 분류 학적 보전성이 높은 유전자를 기반으로 제작된 프라이머를 이용하여 PCR을 적용하여 DNA 복합체 내 타겟 DNA만 선 별적으로 증폭이 가능하게 되었고, 이후 PCR로 타겟 영역이 증폭된 DNA는 차세대 염기서열 분석을 진행하고, 얻은 데이 터를 파이프라인 (Qiime2, dada2, PEMA 등)을 이용하여 생 태학적 분석과 해석을 가능한 기반 자료가 도출이 가능하게 되었다.

환경유전자의 활용과 전망은 가속화되고 있으며, 다양한 분야에서 활용이 가능하다. 희귀종 존재 유무 탐색, 외래종 유입 여부, 공기 속에 유해생물, 수생태계 내 생물의 서식여 부 등 알지 못하는 원인 생물에 대해 신속하게 스크리닝을 할 수 있는 기술이다. 다만 알려진 유전자 정보가 있는 경우 에만 가능하다는 크고 중요한 단점을 가지고 있다. 특히 기존 의 수생태계 생물 모니터링에 소모되는 시간과 비용, 노동력 절감의 대안으로 시도를 하고 있거나 계획을 하고 있다면, 시 행착오와 방법정립에 연구자들의 협력이 필요하다. 시민참여 와 비전문가 그룹에 대한 교육과 이해를 기반으로 시료 수집 의 정확성을 담보할 선제 기술을 요하며, 이 방안이 수립되지 않은 상태에서 진행될 경우 산출된 자료의 신뢰성 문제로 데 이터는 사용되기 힘들게 된다. 분류학적 지식을 기반으로 한 전문가들의 현미경 사용에 의한 종 동정의 기술이 유전자 분 석 장비의 발달로 기계화 대량화가 예고되는 시점이다. 더욱 중요한 것은 대량화된 생물 빅데이터를 다룰 정보 기술과 짧 은 서열정보에서 기인한 오동정을 걸러내기 위한 기초학문 에 대한 지원과 노력이 없다면, 허상 속에 놓인 다량의 데이 터를 분석하지만 효용가치가 없는 자료의 홍수 속에 갇히게 될 수도 있음을 인지하여야 할 것이다.

적 요

국내 생태계의 환경유전자 적용도 가속화되고 있으나 생 산된 데이터를 처리하고 분석하는 데 한계를 느끼고 있으며, 분석 생산된 생물데이터의 신뢰성에 대한 의구심이 제기되 기도 하고 시료 매체 (대상 시료, 물, 공기, 퇴적물, 위내용물, 분변 등) 간의 방법에 따른 차이와 분석 방법의 정량화와 개 선 등이 필요한 상태이기도 하다. 따라서 국내 생태계의 환경 유전자를 활용한 생물다양성 연구의 신뢰성과 정확성을 확 보하기 위해서는 생태분류학으로 축적된 데이터베이스를 적 극적으로 활용하여 검증 절차를 거치고, 유전자 서열 분석으 로 높아진 데이터의 해상력을 전문가들이 검증하는 과정이 반드시 필요하다. 환경유전자 연구는 분자생물학적인 기술 적용으로만 해결될 수 없으며, 생산된 데이터의 신뢰성을 확 보하기 위한 생태-분류-유전학-인포메틱스 등 학제 간의 연 구 협력이 중요하며, 다양한 매체를 다루는 연구자들이 함께 접근할 수 있는 정보 공유 플랫폼이 절실한 분야이며, 발전의 속도도 급격하게 진행될 것이고 축적되는 데이터는 수년 내 에 빅테이터로서 성장할 수 있을 것으로 기대된다.