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ISSN : 2288-1115(Print)
ISSN : 2288-1123(Online)
Korean Journal of Ecology and Environment Vol.53 No.2 pp.165-172
DOI : https://doi.org/10.11614/KSL.2020.53.2.165

Stress Evaluation to Heavy Metal Exposure using Molecular Marker in Chironomus riparius.

Won-Seok Kim1, Kiyun Park2, Ihn-Sil Kwak1,2*
1Department of Ocean Integrated Science, Chonnam National University, Yeosu 59626, Republic of Korea
2Fisheries Science Institute, Chonnam National University, Yeosu 59626, Republic of Korea
*Corresponding author: Tel: +82-61-659-7148 E-mail: inkwak@hotmail.com, iskwak@chonnam.ac.kr
14/05/2020 09/06/2020 09/06/2020

Abstract


Heavy metals are common pollutants in the freshwater environment and have toxicological effect in habitat organisms. The heavy metals highly accumulated in sediment and organism, and observed various physiological responses. In this study, we investigated the molecular response to heavy metal toxicity (Al, Aluminum; Cr, Chromium; Cu, copper; Mn, Manganese; Zn, Zinc) through expression of heat shock protein 40, 70, 90 (HSP40, 70, 90), cytochrome 450 (CYP450), Glutathione S-transferase (GST) and Serine-type endopeptidase (SP). HSPs showed up-regulation in Cu and Zn exposures. Furthermore, HSPs expression in treated groups tended to be higher than the control group. The tendency of CYP450 and GST mRNA expression was higher for Cr and Cu than for other exposure group. The expression of SP gene was low at Al exposure and other group were measured to be similar to control. These results suggest that heavy metal toxicity in freshwater ecosystem may affect physiological and molecular process. Also, the comprehensive gene expression in the aquatic midge Chironomus riparius give useful information to potential molecular biomarkers for assessing heavy metal toxicity.



분자지표 유전자 발현을 통한 Chironomus riparius 중금속 노출 스트레스 평가

김 원석1, 박 기연2, 곽 인실1,2*
1전남대학교 해양융합과학과
2전남대학교 수산과학연구소

초록


    서 론

    현대 사회는 급속도로 진행되는 산업화로 인해 하천으로 유입되는 오염 물질의 양과 종류가 다양해지고 있으며, 유 입되는 오염원 또한 복잡해지고 있다. 그중 중금속은 환경 내에서 가장 빈번하게 검출되는 오염물질로 자체적인 분해 및 희석이 어려우며, 퇴적물 내 높은 축적을 보인다 (Garcia Sampaio et al., 2008). 또한, 중금속은 서식 생물 체내 축적 정도가 높게 나타나 노출생물의 번식, 성장 및 면역 등에 영 향을 주어 생태계 전반에 영향을 주는 유해물질로 많은 연 구가 보고되었다 (Rand et al., 1995). 세포 성장에 필수적인 ribosomal protein 유전자를 통해 카드뮴 (Cd), 구리 (Cu)와 납 (Pb)이 Chironomus riparius의 성장 단계별 미치는 영향 에 대한 연구가 보고되었다 (Park and Kwak, 2011). 또한, 최 근에는 중금속 농도가 높은 지역에 서식하는 깔따구 종을 대 상으로 종조성 변화와 함께 하순기절 기형과 성충 날개 구조 변형을 관찰하였다 (Arimoro et al., 2018; Arambourou et al., 2019). 수서 곤충은 담수 생태계 내 중요한 요소로서 하천 내 고차 영양 단계에 위치하며 탄소 순환에 기여한다. 이와 같은 수서 곤충은 외부 유해 물질에 대해 분자 수준부터 개체 단 위까지 영향을 받으며 알에서 유충, 번데기 그리고 성충 과정 을 보내는 생활사는 환경 스트레스를 반영하는 지표로서 연 구되고 있다 (Anderson, 1980). C. riparius는 유충 시기에는 하천 저서에서 서식 후, 성충으로 변태 이후는 육상에서 서 식하는 종으로 전반적인 수환경을 반영하는 지표생물로 이 용되며 생태독성학 연구에 활발하게 이용된다 (Martinez et al., 2003;Park and Kwak, 2008). 또한, 염분, 온도 등의 이화 학적 요인과 중금속, 내분비계교란물질 등의 화학물질에 대 한 위해성 평가에도 적합한 생물로 제안되고 있다 (Park and Kwak, 2014; Kim et al., 2019).

    최근 독성 물질에 대한 위해성을 실내만이 아닌 야외 수준 에서 측정되는 농도를 직접적으로 반영하여 독성 실험을 진 행하거나, 환경 중 서식하는 생물을 직접 mRNA 발현 및 형 태적 변이를 통한 건강성 평가에 대한 시도가 진행되고 있다 (Park et al., 2018). 분자지표 유전자를 통한 독성학적 연구는 외부 스트레스로 인한 생물 영향을 체내 세포 수준에서 관찰 할 수 있다. 또한, 연구대상의 조직과 유전자에 따라 항산화, 신진대사, 생식능력 등의 다양한 생리학적 반응을 확인함으로 노출 물질이 생물에게 가져다 주는 영향성에 대해 판단할 수 있다. 기존 연구로는 중금속, 방향족 탄화수소로 오염된 지역 과 건강한 지역에서 서식하는 C. riparius에서 분자적 수준에 서 내분비계와 면역계 내 영향을 측정하고, 성충 날개의 형태 적 변화를 관찰하여 환경오염 정도에 따른 서식 생물 반응에 대한 연구가 보고되었다 (Arambourou et al., 2019). 본 연구 에서는 하천 내 측정된 중금속 농도를 C. riparius에 노출시 켜 실제 야외에서 나타날 수 있는 영향에 대해 관찰하고 분 석에 활용한 유전자들을 환경 위해성 진단을 위한 분자지표 로서 현장 적용 가능성을 파악하고자 진행하였다. 본 연구를 위해 실내 사육 종인 C. riparius를 중금속 (Al, Aluminum; Cr, Chromium; Cu, copper; Mn, Manganese; Zn, Zinc)에 노 출 후 분자지표유전자 (Heat shock protein 40, HSP40; Heat shock protein 70, HSP70; Heat shock protein 90, HSP90; Cytochrome 450, CYP450; Glutathione S-transferase, GST; Serine-type endopeptidase, SP) 발현을 분석하였다.

    재료 및 방 법

    1. 실험생물

    연구 대상 종인 C. riparius는 OECD 표준 사육방법에 따 라 계대사육 중인 개체를 이용하였다. 사육 조건은 항온기 내 부온도 20±1℃, 습도 60%, 광도 500 lx, 광주기 16 : 8로 진 행하였으며 사육수는 M4 배지를 이용하였다 (Elendt, 1990). 저서에서 서식하는 환경조성을 위해 모래 (<63 μm)를 투입 하였다. 먹이로는 Tetramin (Tetra-Werke, Melle, Germany) 을 갈아서 매일 0.5 mg day-1씩 공급하였다.

    2. 노출 실험 및 조건

    노출 물질로 이용된 Al, Cr, Cu, Mn, Zn은 Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo, USA)에서 구입하였으며, M4 배지를 통해 stock solution을 제조하여 노출을 진행하였다. 실제 환경 내 존재하는 농도를 기반으로 저농도, 중간농도, 고농도 (Al: 7108, 12158, 22513 mg L-1, Cr: 8.5, 13.8, 16.4 mg L-1, Cu: 8.6, 14.9, 27.5 mg L-1, Mn: 236.5, 391.3, 456 mg L-1, Zn: 93, 114.1, 129.8 mg L-1)로 나누어 진행하였다 (Fig. 1) (Kim et al., 2015). 노출 실험을 위해 실내 사육 중인 C. riparius 4 령기를 선별하여 진행하였으며, 300 mL 유리비커를 이용하 여 진행하였다. 각 비커당 20개체씩 분배하고 3반복구로 노 출실험을 진행하였으며 개체 간 공식을 방지하기 위해 소 량의 tetramin을 공급하였다. 노출실험 조건은 사육환경과 동일하며, 개체치사는 스포이드를 이용한 물자극에 대한 반 응으로 판단하였다. 중금속 노출 스트레스에 대한 분자지표 유전자 발현을 측정하기 위해 노출 96시간때 각 농도당 3 마리씩 추출하여 유전자 발현 실험 전까지 - 80℃에서 보 관하였다.

    3. 분자지표 측정을 위한 유전자 발현

    유전자 발현 실험을 위해 RNA 추출은 Trizol (Invirogen, Scotland, UK)을 이용하였으며, genomic DNA 제거를 위 해 DNase I (Takara, Japan) 처리를 진행하였다. 이후, 추출 한 total RNA 정량을 위해 1.2% agarose gel 전기영동장치 와 Gene-Quant 1300 (GE Healthcare, UK)을 이용하여 수 행하였다. cDNA 합성은 4 μg total RNA와 random hexamer 프라이머를 이용하여 SuperScript® III RT kit (Invitrogen, Scotland, UK)로 합성하였다. 유전자 발현을 위한 내부 적 대조군 (Internal control)은 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 이용하였다. 유전자 발현량 측 정은 AB7300 Real Time PCR system (Applied Biosystem, Foster Citay, CA, USA)과 SYBR green mixture (Takara, Japan)를 통해 94℃에서 20초, 55℃에서 40초 후 72℃에 서 40초로 38회 실시하였다. 각 유전자 발현량은 AB7300 System SDS software을 이용하여 분석하였다.

    4. 통계적 자료 분석

    분자지표 유전자 발현량은 standard curve를 기준으로 GAPDH의 발현량을 internal control로 표준화하였다. 노출 대상과 대조군 간 유의성을 확인하기 위해 SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 Tukey’s multiple range test로 분석하였다 (p<0.05). 또한, 유전자 발현 간 연관성 과 상관성 파악을 위해 R (ver. 3.6.1) 프로그램을 이용하여 heatmap과 correlation analysis를 진행하였다.

    결과 및 고 찰

    1. 중금속 노출에 따른 HSPs 유전자 발현

    HSPs에 속하는 HSP40, HSP70, HSP90 유전자 발현 결 과 전체적으로 Cu와 Zn이 다른 노출군에 비해 발현이 증가 하는 경향을 보였다 (Fig. 2). HSP40 유전자 발현에서 Al, Cr, Mn은 저농도와 고농도에서 중간농도에 비해 상대적으로 높 은 유전자 발현을 보였으나 대조군과 비슷한 수준의 발현량 이 관찰되었다. Cu와 Zn은 다른 물질에 비해 상대적으로 높 은 HSP40 발현을 보였으며, 농도의존적인 경향을 나타냈다. HSP70은 Al과 Zn에서 농도의존적으로 발현량이 증가함이 관찰되었으며 Cu 고농도군에서 가장 높은 HSP70 발현량을 나타냈다. HSP90은 Al을 제외한 모든 중금속에 대해 저농도 와 고농도가 중간농도에 비해 높은 발현을 보였으며 Cu가 전 체적으로 높은 발현을 나타냈다. HSPs는 생물 체대 대사 작 용과 세포 활동에 있어 중요한 역할을 하며, 외부적 스트레스 에 대한 분자마커로서 많은 연구가 진행되고 있다 (Ireland et al., 2004). HSPs에는 분자량에 따라 HSP40, 70, 90, 100과 small HSPs 등으로 구분된다 (Kregel, 2002). HSPs는 샤페론 접합 (folding), 전좌 (translocation) 등의 활동을 통해 중금속 스트레스로 발생하는 산화 스트레스로부터 단백질의 항상성 을 유지하는 역할을 수행하는 것으로 보고되고 있다 (Hall, 2002). 본 연구에서 HSPs 발현 결과는 다른 중금속 물질에 비해 Cu에서 높은 발현을 나타냈다. 기존 연구에 의하면 Cu 에 노출된 송어 (Oncorhynchus mykiss)에서 발생된 활성산 소와 apoptosis로부터 간세포 보호를 위해 HSP70 발현이 증 가함이 보고되었다 (Feng et al., 2003). 또한, 구충제로 이용 되는 fenbendazole 노출에 대해 C. riparius 내 HSP40, 70, 90 발현이 농도 의존적으로 증가되었다 (Park et al., 2009). 최근 HSPs는 이러한 특징을 통해 분자마커로서 많은 연구가 보고되며, 야외 환경에서 나타나는 다양한 스트레스 원인에 대하여 서식생물을 대상으로 시도한 연구가 보고되고 있다 (Arambourou et al., 2019). 해양 양식장에서 사육하는 지중 해담치 (Mytilus galloprovincialis)와 굴 (Crassostrea gigas) 을 대상으로 성장 정도와 HSP70 유전자 발현을 통해 어장환 경 평가가 보고되었다 (Kim et al., 2016). 또한, C. riparius 를 대상으로 중금속 오염이 진행된 외부 현장수 노출에 따른 HSPs 유전자 발현의 증가가 관찰되었다 (Kim et al., 2015).

    2. 중금속 노출에 따른 CYP450과 GST 유전자 발현

    CYP450 유전자 발현 결과, Al과 Mn, Zn은 대조군 발현 과 비슷한 수준을 보였다 (Fig. 2). 전체 노출군 중 Cr과 Cu가 다른 노출군에 비해 상대적으로 높은 발현량을 보였으며, 저 농도와 고농도에서 CYP450 발현이 높게 나타남을 관찰하였 다. 또한, GST 유전자 발현은 Mn을 제외한 Al, Cr, Cu, Zn 노출군에서 대조군에 비해 높은 유전자 발현이 관찰되었다 (Fig. 3). 특히, Cr과 Cu에서는 고농도가 다른 농도군에 비해 상대적으로 높은 수준의 발현량이 관찰되었다. CYP450은 스테로이드 호르몬이나 중금속과 같은 외인성 물질 해독에 관여하는 요소로, 박테리아부터 포유류까지 모든 생물에서 존재하는 것으로 알려져 있다 (Kostaropoulos et al., 2005). 곤충 내 CYP450은 호르몬이나 지방산, 스테로이드와 같은 내인성 합성 요소를 규제하며, 생물 내 성장, 발달 및 번식 에 관여한다 (Scott, 1999;Feyereisen, 1999). 또한, CYP450 은 다양한 효소 채널을 통해 생물 체내 산화-환원 시스템 매 개체로서의 기능이 보고되었다 (Danielson, 2002). 이와 같 은 CYP450 활성에 대한 억제는 해독과 산화 시스템에 문제 를 야기하게 되어 체내 활성산소 축적을 유도하게 된다 (Lin and Lu, 1998). GST는 외부 물질에 대한 해독에 가장 중요 한 역할을 하는 효소로서 세포 내 운반과 호르몬 합성, 산화 스트레스로부터 방어기작 등을 수행하는 것으로 보고된다 (Enayati et al., 2005). 수서 생물 세포 내 GST는 생물적 환 경 정화 과정에 영향을 주며, 활성 산소로부터 세포를 보호한 다 (Creaney et al., 1995). CYP450과 GST는 환경 중에서 나 타나는 다양한 물질에 대한 생물 체내 해독 기작에 관여하는 유전자로 많은 연구가 보고되고 있다. C. riparius에서 구충 제로 이용되는 fenbendazole 1~30 μg L-1 노출이 항산화 유 전자들의 활성증가에 농도의존적으로 나타냈다 (Park et al., 2009). 최근에는 나일틸라피아 (Oreochromis niloticus)에 간 과 비장에서 육가크로뮴 (Hexavalent chromium) 노출에 따 라 GST와 CYP 활성이 증가하며 독성 영향으로 인해 조직 변화가 보고되었다 (Mohamed et al., 2020). 본 연구 결과, 중 금속 노출에 따라 CYP450과 GST 유전자의 발현증가가 확 인되었으며 이는 중금속 독성으로 인해 발생한 C. riparius 체내 활성산소와 함께 항상성 유지를 위한 반응으로 보인다. 또한, 다른 중금속에 비해 Cr과 Cu에서 상대적으로 높은 발 현이 측정된 것은 생물 체내에 다른 중금속 이온에 비해 단 시간에 쉽게 흡수되어 나타난 경향으로 판단되며 추후 중금 속 독성에 대한 장기 노출에 따른 발현 경향을 분석해야 할 것으로 사료된다.

    3. 중금속 노출에 따른 SP 유전자 발현

    단백질 분해 효소는 기생충의 소화 과정 내 주요 구성 요 소로서 숙주 조직과의 상호작용을 위해 기능을 한다 (Rhoads and Fetterer, 1997). SP는 곤충 내에 존재하는 단백질 분해 효소로 알려져 있으며 (Terra et al., 1996), 혈액응고, 면역 반 응, 호르몬 활동과 성장 등 다양한 생리적 작용에도 관여하는 것으로 보고되고 있다 (Barrett et al., 2003). 본 연구 결과, SP 유전자 발현은 Al을 제외한 모든 노출군에서 대조군과 큰 차 이를 나타내지 않았다. Al은 다른 노출군에 비해 상대적으로 낮은 발현량을 보였으며, 저농도에서 고농도로 감에 따라 발 현량이 감소하는 경향이 관찰되었다 (Fig. 4). 기존 연구에 의 하면 SP 유전자는 본 연구에서 관찰한 HSPs, CYP450, GST 등과는 다르게 생물 내 일정 수준을 유지하고 있으며, 외부 자극에 대해 독성 영향을 받는 경우 감소하는 것으로 보고되 고 있다 (Park and Kwak, 2008). 또한, Al 독성은 C. riparius 소화에 관여하는 침샘 유전자의 구조 및 기능적 손상을 주어 발현 감소에 대한 기존 연구와 비슷한 연구 결과가 보고되었 다 (Michailova et al., 2003).

    4. 히트맵 (Heatmap)을 이용한 분자지표 유전자 발현

    중금속 노출에 따른 분자지표 유전자 발현을 히트맵과 클 러스터링으로 분석한 결과, 유전자 발현은 각각 SP와 HSPs 그리고 GST, CYP450으로 각각 3개의 그룹으로 분류되 었다 (Fig. 5). 또한 상관성 분석 결과, HSPs 그룹에 속하는 HSP40, 70, 90은 서로 높은 상관성을 보였다 (Table 2). 또 한, CYP450은 HSP70, 90과 유의한 수준의 상관성을 나타 내었으며 GST와는 높은 유의 수준에서 양의 상관성을 관찰 하였다. 히트맵에서 다른 그룹에 속하는 SP는 다른 유전자 들과의 상관성 분석에서 유의성을 보이지 않았다. 노출 물 질과 농도에 대한 히트맵 결과 Cr과 Cu는 각각 다른 그룹으 로 분류되고, Al, Mn, Zn과 대조군은 같은 그룹으로 분류되 어 3개의 그룹을 관찰하였다. 본 연구에서 관찰한 유전자 발 현에 따른 히트맵과 상관성 분석 결과는 각기 다른 생리학적 기작을 지닌 유전자들에 대한 발현 경향성 파악에 용이하며 최근 다양한 연구에서 활용되고 있다. Park et al. (2016)은 방호도료의 주 성분으로 이용되는 Irgarol 노출에 대해 칠게 (Macrophthalmus japonicus) 아가미와 간췌장 내 chitinase, ecdysone receptor 등의 유전자 발현을 히트맵으로 보고하 였다. 연구 결과에서 관찰한 히트맵과 상관성 분석은 HSPs, SP, GST와 CYP450이 각각 면역, 해독, 소화 효소에 관여하 는 특징이 반영된 결과로 판단된다.

    적 요

    중금속은 다양한 경로를 통해 환경 중 배출되어 서 식 생물에 노출되며 체내 다양한 생리학적 불균형을 유 도한다. 본 연구에서는 수서생물지표종으로 이용되는 깔 따구 (Chironomus riparius)를 이용하여 야외 중금속 (Al, Aluminum; Cr, Chromium; Cu, copper; Mn, Manganese; Zn, Zinc) 농도 노출에 따른 다양한 분자발현 반응과 상관성 을 분석하였다. 생물 체내 분자 반응을 관찰하기 위해 heat shock protein 40, 70, 90 (HSP40, 70, 90), cytochrome 450 (CYP450), Glutathione S-transferase (GST) and Serine-type endopeptidase (SP)를 이용하였다. 그 결과, 스트레스 분자마 커로 이용되는 HSPs 유전자들은 중금속 노출된 개체들에서 대조군보다 높은 경향을 보였으며 Cu 노출 시 가장 높은 발 현을 나타냈다. 해독에 관여하는 CYP450과 GST 유전자 발 현 결과, Cr과 Cu에서는 다른 노출군에 비해 높은 발현 경향 을 나타냈다. SP 유전자 발현 결과 Al을 제외한 모든 노출군 이 대조군과 유사한 발현 패턴을 보였다. 이와 같은 연구 결 과는 실내에서 환경 중 존재하는 실제 농도를 반영한 독성실 험을 통해 노출물질과 농도에 따라 특이적으로 발현하는 분 자마커 패턴을 보고하였다. 또한, 수생태계로 유입되는 중금 속이 하천에 서식하는 생물에 주는 유해 영향에 대한 정보와 분자 지표 유전자들의 현장 적용 가능성을 보여준다.

    이해관계

    본 연구는 이해관계의 충돌 여지가 없습니다.

    연구비

    본 연구는 한국연구재단 중점연구사업 [NRF-2018- R1A6A1A-03024314]의 지원을 받아 수행된 연구입니다.

    저자기여도

    개념설정: 곽인실, 방법론: 곽인실, 박기연, 자료 분석: 김원석, 박기연, 자료제공: 박기연, 김원석, 자료관리: 곽 인실, 박기연, 김원석, 원고 초안작성: 김원석, 원고 교정: 김 원석, 박기연, 원고 편집 및 검토: 김원석, 박기연, 곽인실, 과 제관리: 곽인실, 연구비 수주: 곽인실

    Figure

    KSL-53-2-165_F1.gif

    Concentration of heavy metals in sediment.

    KSL-53-2-165_F2.gif

    mRNA expression of HSPs (A: HSP40, B: HSP70, C: HSP90) genes in C. riparius larvae exposed to heavy metals for 96 hours.

    KSL-53-2-165_F3.gif

    mRNA expression of detoxification (A: CYP450, B: GST) genes in C. riparius larvae exposed to heavy metals for 96 hours.

    KSL-53-2-165_F4.gif

    mRNA expression of SP genes in C. riparius larvae exposed to heavy metals for 96 hours.

    KSL-53-2-165_F5.gif

    Heatmap of relative mRNA expression level of HSP40, HSP70, HSP90, CYP450, GST and SP in C. riparius exposed to different concentration of heavy metals.

    Table

    Primers used to amplify specific genes.

    The result of correlation analysis between specific genes.

    List of gene expression studies in Chironomus riparius.

    Reference

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