Journal Search Engine
Search Advanced Search Adode Reader(link)
Download PDF Export Citaion korean bibliography PMC previewer
ISSN : 2288-1115(Print)
ISSN : 2288-1123(Online)
Korean Journal of Ecology and Environment Vol.53 No.1 pp.63-72
DOI : https://doi.org/10.11614/KSL.2020.53.1.063

Application of Environmental DNA for Monitoring of Freshwater Fish in Korea.

Jeong-Hui Kim, Hyunbin Jo1, Min-Ho Chang2, Seung-Hyun Woo2, Youngho Cho3, Ju-Duk Yoon4*
EcoResearch incorporated, Gongju 32588, Republic of Korea
1Fisheries Science Institute, Chonnam National University, Yeosu 59626, Republic of Korea
2Environment Impact Assessment Team, National Institute of Ecology, Seocheon 33657, Republic of Korea
3Department of Research Policy, National Institute of Ecology, Seocheon 33657, Republic of Korea
4Research Center for Endangered species, National Institute of Ecology, Yeongyang 36531, Republic of Korea
*Corresponding author: Tel: +82-54-680-7360, Fax: +82-54-680-7329 E-mail: grandblue@nie.re.kr, zmszmsqkek@hanmail.net
25/02/2020 17/03/2020 17/03/2020

Abstract


In this study, to discuss on the applicability of eDNA as a new method to investigate fish diversity at streams, we applied eDNA at 4 streams (Geum River, Ji Stream, Hwangji Stream, Seomjin River), where endangered species are inhabits, with conventional survey (cast net and kick net). The average (±standard deviation) number of species investigated by eDNA were 19 species (±4.4), and it was relatively higher than average of conventional survey, 10 species (±4.8). Most of case, in this study, eDNA was more efficient than conventional survey. However, there were errors on species identification of Korean endemic species and aliied species from eDNA, and it seems the universal primer (MiFish primer set) is not suitable for them. Furthermore, some of endangered species, caught by conventional method, was not detected by eDNA. As the present universal primer is not suitable for identify the every freshwater fish species in Korea, the complementing or development of universal primer is needed, and the eDNA application after species specific marker development for detecting specific species like endangered species should be considered. In conclusion, if the manual for field survey method by eDNA is developed, we expect applicability enlargement for water ecosystem survey.



환경유전자의 국내 담수어류 모니터링 적용 연구

김 정희, 조 현빈1, 장 민호2, 우 승현2, 조 영호3, 윤 주덕4*
주식회사 에코리서치
1전남대학교 수 산과학연구소
2국립생태원 환경영향평가팀
3국립생태원 연구정책부
4국립생태원 멸종위기종복원센터

초록


    Ministry of Environment
    NIE-기반연구-2018-04

    서 론

    환경유전자 (environmental DNA, eDNA)는 흙, 퇴적물, 수체 등 다양한 환경에 잔존하는 생물의 유전자를 의미하 며, 배설물, 땀, 침, 피부조직, 털 등 다양한 형태를 띠고 있 다 (Taberlet et al., 2012, Thomsen and Willerslev, 2015). eDNA는 1987년 흙속 침전물로부터 미생물 DNA를 추 출 (Ogram et al., 1987)하면서 처음 언급되기 시작했으며, 2000년대 들어와서야 활용되기 시작했다. 최근 유전자 분 석 기술의 진보로 미량의 유전자를 분석할 수 있는 기술 이 개발되면서, 환경에 잔존하고 있는 유전자를 통해 생 물의 서식 유무를 파악하는 연구가 전 세계적으로 진행되 고 있다 (Ficetola et al., 2008;Jerde et al., 2011;Minamoto et al., 2012). 특히, 하천, 호수, 바다와 같은 수환경에서 는 서식하는 모든 생물에 대한 유전정보가 물에 포함되 어 있으며, 이는 비교적 간편하게 획득하고 분석할 수 있 기 때문에 수생생물들을 대상으로 많은 연구들이 수행되 고 있다 (Sassoubre et al., 2016;Shaw et al., 2016;Evans et al., 2017). 구체적으로 생물다양성 (Andersen et al., 2011;Thomsen et al., 2012a;DiBattista et al., 2017;Nakagawa et al., 2018), 종 분포 (Takahara et al., 2013;Yamamoto et al., 2016), 희소종 확인 (Thomsen et al., 2012b;Keskin et al., 2016;Piggott 2016;Doi et al., 2017)에 대한 연구가 활발 하게 이루어지고 있다.

    eDNA를 활용한 수생생물 조사는 수체 내 잔존 유전자 를 분석하기 때문에 포획을 통한 종의 출현 유무 파악 없 이도 생물의 존재 여부를 확인할 수 있는 방법이다. eDNA 조사는 지점의 현장수 시료만 확보하면 되기 때문에 조사 지점에 대한 접근성, 생물의 불균일한 분포 등과 같이 조 사 환경에 의한 영향이 적으며, 현장 조사 시 소요되는 인 력 및 시간을 절감할 수 있는 장점이 존재한다 (Laramie, et al., 2015). 뿐만 아니라, eDNA 연구 결과에서 전통적인 생 물 조사 방법과 비교하여 다양한 종이 확인되었으며 (e.g. Dejean et al., 2012;Takahara et al., 2013), 희소하게 분포 하는 종의 서식 여부가 확인되었다 (Jerde et al., 2011). 따 라서 수생생물 연구에서의 eDNA 조사는 직접포획 조사 방법의 단점을 보완할 수 있는 효과적인 방법이다.

    수생생물 중 상위포식자이자 이동성이 큰 어류의 경우 주로 어구 (투망, 족대, 정치망, 자망 등)를 활용한 채집을 통해서 종 다양성을 확인한다. 직접포획에 의한 방식은 어 구별 단위노력당 어획량 (catch per unit effort, CPUE)과 같 은 정량적인 결과를 산출할 수 있고, 채집되는 종들을 연 구자들이 직접 확인할 수 있다는 장점이 있다. 반면, 각 어 구들의 형태 및 특성상 존재하는 편향성 (gear selectivity) 으로 인하여 조사 대상 지역의 어류 다양성 및 특정종의 개체군 크기가 저평가될 수 있는 문제가 있다 (Bonar et al., 2009, Yoon et al., 2015). 또한 채집이 어려운 환경에 서식 하거나 멸종위기종과 같이 개체수가 적은 종들을 확인하 지 못할 가능성이 높으며 (Thomsen et al., 2012b), 이를 채 집하기 위해서는 많은 시간과 인력이 소요되어야 한다. 따 라서, 직접포획의 단점을 보완하기 위해서 어류 조사에 있 어서 eDNA를 활용하는 방안에 대한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다.

    미국 (U.S Geological Survey, USGS)과 덴마크 (eDNA center) 에서 eDNA 조사를 국가 차원에서 활용하고 있으 며, 일본 (The eDNA Society)에서도 많은 연구자들에 의 해서 연구가 이루어지고 있다. 국내도 eDNA의 활용을 높 일 필요가 있으나, 현재까지는 제한적인 연구만 수행되어, 보다 활발한 연구를 통해 국내에 적합한 방법 정립 및 조 사 체계 정착이 필요한 상황이다. 본 연구에서는 담수생 태계 중 하천에 서식하는 어류를 조사하기 위한 방법으로 eDNA를 적용하였다. 특히, 개체수가 적고 채집이 어려운 멸종위기종이 서식하는 하천에 대해서 eDNA를 활용하여 어종의 다양성을 확인하였으며, 이를 통해 국내 수환경 연 구에서의 eDNA의 적용 가능성을 파악하였다.

    재료 및 방 법

    1. 조사지점

    eDNA의 적용 가능성 평가를 위한 조사는 금강 본류, 지 천 (금강 지류), 낙동강 황지천, 섬진강 본류의 4개 지점을 대상으로 실시되었다 (Fig. 1). 지점 선정은 어류상과 멸종 위기종의 서식 유무 확인 가능성 파악을 위해 문헌상 멸종 위기종이 1종 이상 (금강, 감돌고기; 지천, 흰수마자; 황지 천, 얼룩새코미꾸리; 섬진강, 큰줄납자루) 서식하는 지점을 선정하였다.

    2. eDNA 분석

    1) 현장 채수 및 필터링

    eDNA 분석을 위한 물 시료 채수 및 필터링에 대한 전 반적인 과정은 USGS의 “Environmental DNA sampling protocol (Laramie, et al., 2015)”을 따랐다. 현장 채수 및 필터는 2018년 7월 11~12일에 이루어졌다. 채수 시 오염 (contamination)을 방지하기 위하여 지점별로 조사 및 필 터링 도구를 구분하여 사용하였다. 조사 지점에서 물 시 료는 채수병 (2L)을 이용하여 3개의 샘플 (n=3 for each site)을 확보하였으며, 채수된 시료는 hand vacuum pump (Nalgene, Thermo Scientific, U.S.)를 이용하여 현장에서 필터하였다. 필터는 eDNA 필터 시 발생 가능한 오염 방 지를 위해서 Nalgene analytical test filter funnel (Cellulose nitrate; Volume 250 mL; Pore size 0.45 μm; diameter 47 mm; Thermo Scientific, U.S.)을 사용하였으며, 지점별로 750 mL의 원수를 필터하였다. 이후 필터지는 보관을 위해 실리카겔이 들어있는 지퍼백에 개별로 보관하여 실험실로 이송하였으며, 분석 시까지 -20℃에 냉동보관하였다. 현 장에서 필터 후 남은 물 시료는 드라이아이스 박스를 이용 하여 실험실로 옮겨 - 20℃ 미만의 냉장고에 보관하였다.

    2) DNA 추출

    지점별 현장에서 이동, 보관된 필터지의 DNA 추출은 DNeasy PowerWater Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이 용하여 manufacture 권고에 따라 직접 DNA를 추출하였으 며, 추출된 DNA는 - 20℃ 이하의 냉장고에 보관하였다.

    3) Universal primer 선정

    물 속 eDNA에 포함된 어류 DNA 염기서열을 증폭하기 위해 다양한 유전자 마커 (genetic marker)를 대상으로 기 존에 개발된 primer 세트를 확보하였으며, 그중 어류를 대 상으로 한 eDNA의 실험에 많이 사용되고 있는 MiFish primer 세트 (Miya et al., 2015)를 선정하였다 (Table 1).

    4) PCR 반응

    어류의 eDNA를 증폭하기 위해 전체 25 μL의 양 (DNA template 5 μL, AccuPrime SuperMix II 12 μL, forward primer 1.25 μL, reverse primer 1.25 μL, BSA 0.5 μL, D.W. 5 μL)으로 1st PCR을 수행하였다. PCR 조건은 initial denaturation 95℃에서 5 min, 이후 PCR 반응 (denaturation 95℃에서 20 sec, annealing 58℃에서 15 sec, extension 68℃에서 1 min) 35회를 수행하고, final extension 68℃에 서 7 min을 수행하였다. PCR 반응 이후, 전기영동을 통해 밴드를 확인하였다. 특이적 밴드의 DNA 증폭산물을 메스 를 이용하여 추출하고, 이후 QIAquick Gel Extraction Kit Fluorometry (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 정제 하였다.

    2nd PCR은 샘플 index 정보가 삽입된 primer 세트를 이 용하여 수행하였다. 이후 Qubit (Invitrogen, CA, USA)을 이용하여 DNA 농도를 측정한 후, 각 샘플의 농도에 따라 용량을 조절하여 풀링 (pooling)하였다.

    5) NGS 분석 및 데이터 정리

    Nextseq (Iumina, CA, USA)을 이용하여 next generation sequencing (NGS) 분석을 수행하였으며, 획득된 염기서열 은 VSEARCH를 이용하여 unique OTUs를 산출하였다. 산 출된 OTUs를 GenBank Database에 등록되어 있는 염기서 열 정보를 대상으로 BLASTn을 수행 (≥99%)하였으며, 동 정된 (assigned) OTUs 정보를 현장 조사결과 비교 및 전문 가 의견 검토를 통해 지점별 종 리스트를 작성하였다.

    3. 어류 채집

    조사 방법에 따른 어류 다양성 비교를 위해서 국내에서 보편적으로 사용되는 어구를 활용한 채집 방법을 통해 조 사 지점의 어류 다양성을 확인하고 eDNA 분석결과와 비 교하였다. 조사는 환경부에서 발간된 “생물측정망 조사 및 평가지침”의 하천 조사 방법으로 사용되는 투망 (망목, 7×7 mm)과 족대 (망목, 5×5 mm)를 활용하였으며, 투망은 조사 구간 내 10회, 족대는 이동 거리를 포함하여 30분 동 안 조사를 실시하였다 (NIER, 2016). 조사 지점별 어류 채 집은 eDNA 현장 조사 시점과 동일한 시기에 실시하였다. 채집된 어류는 Kim and Park (2002)를 참고하여 현장에서 동정 후 방류하였으며, 종 다양성 비교를 위해서 종별 출 현 유무만을 기록하였다. 출현한 종 목록은 eDNA 분석결 과의 OTUs 양이 많은 종에서 적은 종 순서로 배열하였다. 멸종위기 야생생물로 보호 중인 감돌고기 (금강유역환경청 허가번호 제 2018-5호), 흰수마자 (금강유역환경청 허가번 호 제 2018-5호), 얼룩새코미꾸리 (원주지방환경청 허가번 호 제 2018-3호), 큰줄납자루 (영산강유역환경청 허가번호 제 2018-11호)는 “야생생물 보호 및 관리에 관한 법률” 제 14조 제1항 및 동일 법 제13조 제2항의 규정에 따라 수계 를 관리하는 각 환경청으로부터 멸종위기종 포획·방사 허 가서를 발급 후 채집을 시행하였다.

    결과 및 고 찰

    NGS 분석을 통해 얻어진 염기서열 (paired end)은 총 5,850,476개이며, 샘플당 평균 487,540개의 염기서열이 얻 어졌다. VSEARCH를 활용하여 필터된 unique OTUs는 총 2,717개를 확인하였다. 이후 NCBI GenBank의 데이터를 바탕으로 BLASTn 분석을 실시하여, 전문가 검토를 통해 지점별 OTUs를 확인한 결과 14~24로 확인되었으며, 이는 각 지점에 서식하는 종 수를 대변하는 결과이다 (Table 2, 3). 지점별 최종 OTUs에 대한 염기서열의 개수는 황지천 이 1,133,075개로 가장 많았으며, 지천이 32,696개로 가장 적었다.

    eDNA 조사를 통해서 확인된 종 수는 지점 평균 (±표준 편차) 19종 (±4.4)이며, 이는 어구를 이용한 조사의 10종 (±4.8)과 비교하여 높은 수치이다. 지점별 비교 시 금강, 지천, 황지천에서 eDNA를 통해서 확인된 종 수가 어구를 이용한 조사와 비교하여 많은 것으로 확인되었으며, 섬진 강은 어구를 이용한 조사에서 eDNA (14종) 조사보다 3종 이 많은 17종이 채집되어 반대의 결과를 보였다 (Tables 2, 3). eDNA를 활용한 어류상 조사 시 직접 확인을 통한 어 류 조사 방법인 통발 (fish pots), 낚시 (angling), 정치망 (fyke nets), 자망 (gill net), 스노쿨 (snorkeling), 지인망 (seine), 저 인망 (trawl)과 비교하여 높은 효율을 나타내는 것으로 제 시되고 있다 (Dejean et al., 2012;Thomsen et al., 2012a;Takahara et al., 2013). 본 연구의 대부분 지점에서 문헌 과 유사한 결과를 확인하였으나, 섬진강 지점에서는 어구 를 이용한 조사에서 더 많은 종이 확인되었다 (Table 3). eDNA 분석을 위한 샘플링 (채수) 시 대상지점의 모든 생물 의 유전자를 확보할 수 없고, 현장 채수는 일반적인 현장 조사와 마찬가지로 순간적으로 이루어지기 때문에 샘플링 시 확보되지 않으면 확인할 수 없다. 또한 물의 흐름이 없 는 환경보다 물의 흐름이 있는 환경에서 eDNA 분석을 통 한 종의 탐색이 어려운 것으로 보고되어 있다 (Rees et al., 2014). 조사가 이루어진 4개 지점은 규모, 수심, 유량, 유 속 등 환경의 차이가 있었으며, 모든 지점에서 물의 흐름 이 빠르게 나타났다 (Fig. 1). 더불어 조사 방법에 대한 경 험 및 국내 환경에 적합한 매뉴얼이 없기 때문에, 지점의 특성을 고려한 조사가 이루어지지 못해서 섬진강 지점의 eDNA 조사의 효율이 낮게 나타난 것으로 판단된다. 따라 서, 결과의 효율성을 높이고 정량화를 위해서는 국내 환경 에 적용 가능한 표준화된 조사 방법이 필요하다. 미국 (U.S Geological Survey, USGS), 일본 (The eDNA society) 등에 서는 이미 eDNA 현장 조사를 위한 매뉴얼이 개발되어 있 으며, 국가별 환경에 맞춰 개발된 매뉴얼은 조사의 편의 뿐만 아니라 결과의 신뢰도를 높일 수 있다. 국내의 경우 eDNA 연구가 개인적인 수준에 그치고 있어서 (e.g. Alam, 2020), 보편적 생태계 조사를 위한 방법 검증 및 매뉴얼 개 발에 대한 개발이 필요하다.

    어구를 활용한 조사와 eDNA를 병용할 경우 지점 평균 23.3종 (± 4.4)의 어류가 확인되며, 지점별 구분 시 19종에 서 27종의 서식이 확인된다 (Fig. 2). 이를 해당 환경에 서 식하는 전체 종으로 가정할 때, eDNA 조사는 지점 평균 83.1% (±20.1), 어구를 활용한 조사는 지점 평균 43.0% (±17.4)의 종 다양성을 확인할 수 있다. 현재 국내 하천에 대한 어류 조사는 대부분 투망과 족대 조사를 통해 이루어 지고 있다. 본 연구 결과에 의하면 이러한 방법이 해당 환 경에 서식하는 약 43%의 어류 종을 확인할 수 있으며, 이 는 eDNA 조사 결과와 비교하여 종 다양성을 확인에 대한 효율이 매우 낮음을 말해준다. 직접적인 포획을 통해 현장 의 어류상을 확인하기 위해서는 장기간 다양한 어구를 이 용할 필요가 있으며, 이 또한 조사지역에 서식하는 어류들 의 생리, 생태, 형태적 특성에 따라 사용 어구가 적합하지 않으면, 포획되지 않을 확률이 높다 (Bonar et al., 2009). 따 라서, 장기간 연구가 아닌 일년 단위 조사를 수행하는 국 내 연구의 특성상 정확한 어류상 파악을 위해서는 사전 조 사 형식의 eDNA 조사를 병행하는 방식이 필수적으로 적 용되어야 할 것으로 판단된다.

    eDNA는 희소한 분포를 하는 종들과 멸종위기종, 외래 종 등 수생생물의 출현을 확인하는 데 있어서 효과적인 방 법이다 (Jerde et al., 2011). 경제성 어종인 뱀장어는 어구에 잘 채집되지 않지만 eDNA 방법을 활용한 조사에서 서식 이 잘 확인된다 (Itakura et al., 2019;Takeuchi et al., 2019). 또한 외부에서 유입된 침입종 (블루길)의 분포를 확인하기 위해서 eDNA 방법이 활용되는 등 (Takahara et al., 2013), 채집이 어려운 특정종의 서식을 확인하기 위한 연구가 다 수 진행 중이다. 멸종위기종은 개체군의 크기가 작고, 종 특이적 생태 습성으로 인하여 보편적인 어구로 채집이 어 려운 종이다. 멸종위기종 서식 확인을 위해 보완적인 방법 으로 eDNA 방법을 활용한 결과, 채집을 통해 나타난 결과 와 다소 차이를 보였다. 금강은 어구 조사에서 채집된 감 돌고기가 eDNA 조사에서도 확인되었으며, 이외 돌상어와 묵납자루 등 멸종위기종이 추가로 확인되었다. 이 중 묵납 자루는 칼납자루의 오류로 판단된다. 황지천은 직접 포획 조사에서 채집된 얼룩새코미꾸리가 eDNA 조사에서 확인 되지 않았으며, 근연종인 새코미꾸리가 확인되었다. 황지 천 지역은 얼룩새코미꾸리의 주요 서식지이지만, 최근 새 코미꾸리의 이입이 이루어졌다 (Chae et al., 2019). 따라서 현재 결과만으로는 새코미꾸리 서식 개체군의 eDNA가 확 인되었을 가능성도 있으나, MiFish primer가 근연종인 얼 룩새코미꾸리를 구분하지 못했을 가능성을 배제할 수 없 다. 이외 eDNA 결과에서 열목어와 돌상어가 확인되었으 나, 돌상어는 낙동강 수계에 서식하지 않는 종으로 오류로 판단된다. 섬진강은 어구 조사에서 큰줄납자루가 채집되었 으나, eDNA 조사에서는 확인되지 않았다. 지천은 문헌 조 사를 통해 목표로 한 흰수마자가 모든 조사에서 확인되지 않았으며, 백조어 한 종만 eDNA 조사를 통해 확인되었다.

    멸종위기종을 제외한 일부 종 (갈겨니, 새코미꾸리, 퉁 가리, 참종개, 검정망둑, 참몰개)에 대해서 염기서열 정보 (NCBI database, Bold systems)의 불완전성과 universal primer의 적절성, 염기서열의 짧은 단편 길이로 인한 eDNA 조사 결과의 오류 가능성 (eDNA 조사에서 확인되었으나, 기 존 문헌 및 과거 조사에서 서식이 확인되지 않는 종)이 확인 되었다 (Tables 2, 3). 금강의 경우 eDNA 조사에서 확인된 갈 겨니는 근연종인 참갈겨니인 것으로 확인되며, 실제로 어구 를 이용한 조사에서 참갈겨니가 출현하였다. 황지천 역시 금 강과 동일하게 갈겨니가 동정되었으나, 현장 조사에서는 참 갈겨니의 서식이 확인되었다. 또한 새코미꾸리, 퉁가리, 참종 개 역시 각각 근연종인 얼룩새코미꾸리, 자가사리, 왕종개의 오류 가능성이 있다. 섬진강에서는 오류 가능성이 확인되지 않았으며, 지천에서 검정망둑, 참몰개가 각각 근연종인 민물 검정망둑과 몰개로 판단된다.

    현재 국제적으로 어류 eDNA 연구를 위한 3개의 universal primer set (Riaz et al., 2011;Miya et al., 2015;Shaw et al., 2016)가 보고되어 있다. 해외에서 개발된 universal primer set은 보편적으로 서식하는 종 및 분자생물학적 연구가 많 이 이루어진 종에 대해서는 명확한 구분이 될 수 있지만, 국 내에만 서식하는 고유종에 대해서는 구분이 어려울 수 있다. 본 연구에서 오류로 확인되는 종 중, 갈겨니와 검정망둑을 제외한 모든 종이 한국 고유종이다. 멸종위기종 역시 대부분 고유종으로 (2019년 기준 27종 중 19종이 고유종) universal primer의 적용에 한계가 있으며, 멸종위기종 특성상 개체군 의 크기가 작아 분석에 충분한 eDNA 양을 확보하기 어려 운 점이 있다. 고유종이 아닌 갈겨니와 관련하여, 2005년에 Kim and Oh (2005)에 의해서 참갈겨니가 신종 및 고유종으 로 등록되었으며, 이 시기 이전에는 국내에서 갈겨니로 분 류되었다. 검정망둑과 민물검정망둑은 분류학적 형질이 매 우 유사하여 분류학적 동정 키 (key)가 명확하게 나타나는 일부 성체를 제외한 개체들을 육안으로 분류하기 어려운 근 연종이다. 특히, 국내 하천 환경에서 MiFish primer를 이용 한 eDNA 연구에서도 검정망둑만이 확인되어 (Alam, 2020), 본 연구에 사용된 primer로 두 종이 구분되지 않음을 확인 할 수 있다. 이러한 결과는 현재 개발된 universal primer의 국내 담수환경에서의 적용에 대한 한계를 명확하게 보여주 고 있으며, 보다 명확한 종 다양성 확인을 위해서는 고유종 을 포함한 국내종에 적합한 primer 개발이 필요한 것으로 사 료된다. 이와 함께 멸종위기종 탐색을 위해서는 목표종에 대 한 종 특이적 마커 개발을 통해, 결과의 정확성을 높이는 방 법을 고려할 필요가 있다. 국내에서 흰수마자를 대상으로 종 특이적 마커 (Cytochrome b 영역 활용)를 개발하여 서식을 확인하는 연구가 이루어지고 있으며 (NIE, 2019), 다른 종에 대해서도 마커 개발이 이루어질 경우 멸종위기종 서식 확인 에 대한 eDNA 방법의 적용이 보다 빨라질 수 있을 것으로 판단된다.

    eDNA는 어류의 다양성을 확인하는 데 있어서 인력 및 시 간을 절감할 수 있는 장점이 존재하며, 무엇보다 어구를 활 용한 채집과 비교하여 많은 종을 확인할 수 있다 (Laramie, et al., 2015). 본 연구에서 어구를 활용한 채집과 비교하여 종 다양성이 높게 나타났으며, 멸종위기종과 같은 희소종의 서식을 확인하였다. 반면, 한국 고유종을 포함한 근연종 및 일부 멸종위기종의 동정에 오류가 확인되어 정확한 종 동정 을 위한 보완이 반드시 필요할 것으로 판단된다. 특히, 조사 의 목적에 따라 지점의 종 다양성을 확인하기 위한 메타바 코딩 (NGS) 방법의 적용을 위해서는 국내 서식 어종을 보다 정확하게 구분할 수 있는 universal primer의 보완 및 개발이 필요하며, 멸종위기종과 같은 특정종의 서식 확인을 위해서 는 종특이적 마커 개발을 통한 적용이 고려되어야 한다. 이 러한 과정 이후 국내 환경에 적합한 현장 조사 방법에 대한 추가적인 검증을 통해 보편적으로 활용 가능한 eDNA 조사 매뉴얼이 만들어질 경우, 결과의 신뢰를 담보한 eDNA 조사 의 활용이 증대될 수 있을 것으로 사료된다.

    적 요

    본 연구에서는 멸종위기종이 서식하는 4개 하천 (금강, 지 천, 황지천, 섬진강)에서 환경유전자 (environmental DNA, eDNA)와 보편적 어구를 이용한 조사 방법을 적용하여 지점 별 종 다양성을 확인하고, 이를 통해 eDNA의 활용을 고찰 하였다. eDNA 조사를 통해서 확인된 종 수는 지점 평균 (± 표준편차) 19종 (±4.4)이며, 이는 어구를 이용한 정량 조사 의 10종 (±4.8)과 비교하여 높게 나타났다. 대부분의 지점 에서 eDNA 조사가 어구를 이용한 조사보다 효율이 높게 나 타났다. 반면 eDNA 조사 결과 고유종 및 근연종에 대해서 동정의 오류가 확인되어, universal primer (MiFish primer set)에 대한 국내 적용의 한계를 확인하였다. 또한 멸종위기 종의 서식 여부도 일부 종에 대해서 eDNA 조사 결과가 현 장 조사 및 문헌과의 차이를 보였다. 현재 개발된 universal primer는 국내에서 서식하는 모든 담수종의 서식을 확인 하는 데 있어서 결과의 신뢰성을 담보할 수 없기 때문에 universal primer의 보완 및 개발이 필요하며, 멸종위기종과 같은 특정종의 서식 확인을 위해서는 종특이적 마커 개발을 통한 적용이 고려되어야 한다. 마지막으로 eDNA의 현장 조 사 방법에 대한 매뉴얼이 개발될 경우, 수생태계 조사에 대 한 활용성이 증대될 수 있을 것이다.

    저자정보

    김정희 (주식회사 에코리서치 대표이사), 조현빈 (전남대학교 수산과학연구소 연구교수), 장민호 (국립생태 원 환경영향평가팀 선임연구원), 우승현 (국립생태원 환경 영향평가팀 전임연구원), 조영호 (국립생태원 연구정책부 책임연구원), 윤주덕 (국립생태원 멸종위기종복원센터 책 임연구원)

    저자기여도

    개념설정: 윤주덕, 조사 및 채집: 윤주덕, 김정 희, 장민호, 우승현, 조영호, 자료분석: 조현빈, 원고작성: 김 정희

    이해관계

    본 논문에는 이해관계 충돌의 여지가 없음.

    연구비

    본 논문은 환경부의 재원으로 국립생태원의 지원 을 받아 수행하였습니다 (NIE-기반연구-2018-04).

    Figure

    KSL-53-1-63_F1.gif

    Map of the study sites.

    KSL-53-1-63_F2.gif

    Fish species diversity identified by eDNA and conventional survey methods of each study sites (bar graph; species number, line graph; percentage of detected species).

    Table

    Universal primer information applied to the study.

    Fish species list identified by eDNA and conventional survey methods in the Geum River and the Ji Stream.

    Fish species list identified by eDNA and conventional survey methods in the Hawangji Stream and the Seomjin River.

    Reference

    1. Alam, J. 2020. Assessment of fish biodiversity in Korean rivers using the environmental DNA metabarcoding technique. Doctor degree. Pukyong National University.
    2. Andersen, K., K.L. Bird, M. Rasmussen, J. Haile, H. Breuning- Medsen, K.H. Kjaer, L. Orlando, M.T.P. Geilbert and E. Willerslev. 2011. Meta-barcoding of ‘dirt’ DNA from soil reflects vertebrate biodiversity. Molecular Ecology 21: 1966-1979.
    3. Bonar, S.A., W.A. Hubert and D.W. Willis. 2009. Standard Methods for Sampling North American Freshwater Fishes. American Fisheries Society, Bethesda, Maryland.
    4. Chae, B., H. Song and J.Y. Park. 2019. A field guide to the freshwater fishes of Korea. LG Evergreen Foundation. Seoul.
    5. Dejean, T., A. Valentini, C. Miquel, P. Taberlet, E. Bellemain and C. Miaud. 2012. Improved detection of an alien invasive species through environmental DNA barcoding: the example of the American bullfrog Lithobates catesbeianus. Journal of Applied Ecology 49: 953-959.
    6. DiBattista, J.D., D.J. Coker, T.H. Sinclair-Taylor, M. Stat, M.L. Berumen and M. Bunce. 2017. Assessing the utility of eDNA as a tool to survey reef-fish communities in the Red Sea. Coral Reefs 36: 1245-1252.
    7. Doi, H., I. Katano, Y. Sakata, R. Souma, T. Kosuge, M. Nagano, K. Ikeda, K. Yano and K. Tojo. 2017. Detection of an endangered aquatic heteropteran using environmental DNA in a wetland ecosystem. Royal Society Open Science 4: 170568.
    8. Evans, N.T., Y. Li, M.A. Renshaw, B.P. Olds, K. Deiner, C.R. Turner and M.E. Pfrender. 2017. Fish community assessment with eDNA metabarcoding: effects of sampling design and bioinformatic filtering. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 74: 1362-1374.
    9. Ficetola, G.F., C. Miaud, F. Pompanon and P. Taberlet. 2008. Species detection using environmental DNA from water samples. Biology Letters 4: 423-425.
    10. Itakura, H., R. Wakiya, S. Yamamoto, K. Kaifu, T. Sato and T. Minamoto. 2019. Environmental DNA analysis reveals the spatial distribution, abundance, and biomass of Japanese eels at the river-basin scale. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems 29: 361-373.
    11. Jerde, C.L., A.R. Mahon, W.L. Chadderton and D.M. Lodge. 2011. “Sight-unseen” detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conservation Letters 4: 150-157.
    12. Keskin, E., E.M. Unal and H.H. Atar. 2016. Detection of rare and invasive freshwater fish species using eDNA pyrosequencing: Lake Iznik ichthyofauna revised. Biochemical Systematics and Ecology 67: 29-36.
    13. Kim, I.S. and J.Y. Park. 2002. Freshwater fishes of Korea. Kyo- Hak Publishing Co, Seoul.
    14. Kim, I.S., M.K. Oh and K. Hosoya. 2005. A new species of cyprinid fish, Zacco koreanus with redescription of Z. temminckii (Cyprinidae) from Korea. Korean Journal of Ichthyology 17: 1-7.
    15. Laramie, M.B., D.S. Pilliod, C.S. Goldberg and K.M. Strickler. 2015. Environmental DNA sampling protocol-filtering water to capture DNA from aquatic organisms (No. 2-A13). US Geological Survey.
    16. Minamoto, T., H. Yamanaka, T. Takahara, M.N. Honjo and Z.I. Kawabata. 2012. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology 13: 193-197.
    17. Miya, M., Y. Sato, T. Fukunaga, T. Sado, J.Y. Poulsen, K. Sato, T. Minamoto, S. Yamamoto, H. Yamanaka, H. Araki, M. Kondoh and W. lwasaki. 2015. MiFish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Royal Society Open Science 2: 150088.
    18. Nakagawa, H., S. Yamamoto, Y. Sato, T. Sado, T. Minamoto and M. Miya. 2018. Comparing local-and regional-scale estimations of the diversity of stream fish using eDNA metabarcoding and conventional observation methods. Freshwater Biology 63: 569-580.
    19. NIE. 2019. Specific monitoring of distribution of Gobiobotia naktongensis (endangered species level 1) in Geum River watershed. National Institute of Ecology. Yeongyang.
    20. NIER. 2016. Biomonitering survey and assessment manual. National institute of environmental research. Incheon.
    21. Ogram, A., G.S. Sayler and T. Barkay. 1987. The extraction and purification of microbial DNA from sediments. Journal of Microbiological Methods 7: 57-66.
    22. Piggott, M.P. 2016. Evaluating the effects of laboratory protocols on eDNA detection probability for an endangered freshwater fish. Ecology and Evolution 6: 2739-2750.
    23. Rees, H.C., B.C. Maddison, D.J. Middleditch, J.R. Patmore and K.C. Gough. 2014. The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology. Journal of Applied Ecology 51: 1450-1459.
    24. Riaz, T., W. Shehzad, A. Viari, F. Pompanon, P. Taberlet and E. Coissac. 2011. ecoPrimers: inference of new DNA barcode markers from whole genome sequence analysis. Nucleic Acids Research 39: e145-e145.
    25. Sassoubre, L.M., K.M. Yamahara, L.D. Gardner, B.A. Block and A.B. Boehm. 2016. Quantification of environmental DNA (eDNA) shedding and decay rates for three marine fish. Environmental Science & Technology 50: 10456-10464.
    26. Shaw, J.L., L.J. Clarke, S.D. Wedderburn, T.C. Barnes, L.S. Weyrich and A. Cooper. 2016. Comparison of environmental DNA metabarcoding and conventional fish survey methods in a river system. Biological Conservation 197: 131-138.
    27. Taberlet, P., E. Coissac, M. Hajibabaei and L.H. Rieseberg. 2012. Environmental DNA. Molecular Ecology 21: 1789-1793.
    28. Takahara, T., T. Minamoto and H. Doi. 2013. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PloS One 8: e56584.
    29. Takeuchi, A., S. Watanabe, S. Yamamoto, M.J. Miller, T. Fukuba, T. Miwa, T. Okino, T. Minamoto and K. Tsukamoto. 2019. First use of oceanic environmental DNA to study the spawning ecology of the Japanese eel. Anguilla japonica. Marine Ecology Progress Series 609: 187-196.
    30. Thomsen, P.F. and E. Willerslev. 2015. Environmental DNA - An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biological Conservation 187: 4-18
    31. Thomsen, P.F., J. Kielgast, L.L. Iversen, P.R. Møller, M. Rasmussen and E. Willerslev. 2012a. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS One 7: e41732.
    32. Thomsen, P.F., J. Kielgast, L.L. Iversen, C. Wiuf, M. Rasmussen, M.T. Gilbert, L. Orlando and E. Willerslev. 2012b. Monitoring endangered freshwater biodiversity using environmental DNA. Molecular Ecology 21: 2565-2573.
    33. Yamamoto, S., K. Minami, K. Fukaya, K. Takahashi, H. Sawada, H. Murakami, S. Tsuji, H. Hashizume, S. Kubonaga, T. Horiuchi, M. Hongo, J. Nishida, Y. Okugawa, A. Fujiwara, M. Fukuda, S. Hidaka, K.W. Suzuki, M. Miya, H. Araki, H. Yamanaka, A. Maruyama, K. Miyashita, R. Masuda, T. Minamoto and M. Kondoh. 2016. Environmental DNA as a ‘snapshot’ of fish distribution: A case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS One 11: e0149786.
    34. Yoon, J.D., J.H. Kim, H.J. Lee and M.H. Jang. 2015. Use of the cast net for monitoring fish status in reservoirs distributed in the Korean peninsula. Journal of Ecology and Environment 38: 383-388.