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ISSN : 2288-1115(Print)
ISSN : 2288-1123(Online)
Korean Journal of Ecology and Environment Vol.50 No.1 pp.137-147
DOI : https://doi.org/10.11614/KSL.2017.50.1.137

Analysis of Potential Toxigenicity and Phylogeny using Target Genes in Aphanizomenon flos-aquae (Cyanophyceae) strains isolated from the Nakdong River.

Hui-Seong Ryu, Sung-Min An1, Chang-Kun Lim2, Ra-Young Shin, Jong-Guen Park3, Jung-Ho Lee*
Department of Biology Education, Daegu University
1Korean Institute of Ocean Science & Technology
2Department of Biological Science, Daegu University
3Department of Earth Science Education, Daegu University
Corresponding author : +82-53-850-6994, +82-53-850-6979, jungho@daegu.ac.kr
February 15, 2017 March 27, 2017 March 27, 2017

Abstract

The identity of toxin producers remains only hypothesis unless there were identified by strain isolation and analytical confirmation of both the cyanotoxin production and the genetic identity of the monoculture. The purposes of this study were to identify a morphologic and phylogenetic classification in Aphanizomenon flos-aquae strains isolated from the Nakdong River and to investigate the potential ability of the strains to produce toxins such as saxitoxin and cylindrospermopsin using target genes. The 16S rRNA and sxtA, sxtI, cyrA, cyrJ genes were analyzed on two strains (DGUC001, DGUC003) isolated from the Nakdong River. Morphological features of the strains were observed a shape of aggregated trichomes in parallel fascicles which can reach up to macroscopic size and a hyaline terminal cell without aerotope. In addition, the 16S rRNA phylogenetic analyses showed that the strains were identified as the same species with high genetic similarity of 98.4% and grouped within a monospecific andsupported cluster I of Aphanizomenon flosaquae selected from GenBank of the NCBI. The cyrA and cyrJ genes encoding for the cylindrospermopsinbiosynthesis were not detected in the present study. The sxtA gene was in detected both the two strains, whereas the sxtI gene which had been suggested as a suitable molecular marker to detect saxitoxin-producing cyanobacteria was not found both the strains. Thus, the two strains isolated from Nakdong River were identified as the same species of Aphanizomenon flos-aquae Ralfs ex Bornet et Flahault 1888, the two strains were confirmed as potential non-producing strains of the saxitoxin and cylindrospermopsin.


낙동강에서 분리된 Aphanizomenon flos-aquae (Cyanophyceae) 균주의 목 표 유 전자를 이용한 잠재적 독 소 생성능 및 계통학적 분 석

류 희성, 안 성민1, 임 창건2, 신 라영, 박 종근3, 이 정호*
대구대학교 생물교육전공
1한국해양과학기술원
2대구대학교 생명과학과
3대구대학교 지구과학교육전공

초록


    Daegu University

    서 론

    Aphanizomenon속은 전 세계적으로 담수생태계에서 널 리 분포하며, 과다 증식하여 유해한 수화현상 (Harmful cyanobacterial bloom)을 빈번하게 발생시킨다 (McDonald and Lehman, 2013). Aphanizomenon속에 의한 수화현상 은 간독소 (hepatotoxin)와 신경독소 (anatoxin, aphantoxin, saxitoxin), 세포독소 (cylindrospermopsin)와 같은 2차 대사 산물을 유발하여 인간과 동물에게 심각한 질환을 일으키 고, 일부 경우에는 사망에 이르게 할 수 있다 (KokoCiński, 2013; Zhang et al., 2015). 세계적으로 많은 국가에서 Aphanizomenon속에 속하는 대부분의 분류군은 잠재적 독 소 생성 분류군으로 간주되고 있으며 (Brient et al., 2009; Ballot et al., 2010a; Casero et al., 2014), 국내의 경우 아직 까지 Aphanizomenon속의 독소에 의한 직접적인 피해사례 는 없었으나, 모든 분류군을 유해남조류로 분류하고 있다 (Park et al., 2015).

    Aphanizomenon속에서 생성되는 saxitoxin (STX)은 총 26개의 유전자로 암호화된 다효소 복합체에 의해 생합성 되는 것으로 추정되며, cluster의 크기는 약 27.5 kb이다 (Mihali et al., 2009). 이 중 sxtA 유전자는 saxitoxin 생합 성의 첫 번째 단계를 개시하는 폴리케티드 (polyketide) 생 합성을 암호화하며, 독소 생성 균주뿐만 아니라 모든 독 소 비생성 균주에서도 발견된다 (Ballot et al., 2010b; Cirés et al., 2014). 반면, sxtI 유전자는 saxitoxin 생합성 유전자 cluster 중 유일하게 STX 독소 생성능이 있는 균주에서만 발견되는 유전자이며, STX 독소 생성 가능성을 의미하는 특이적인 지표로 고려되어진다 (Caesro et al., 2014). 세포 독인 cylindrospermopsin (CYN)을 암호화하는 cyr cluster 는 11개의 유전자로 구성되며, 약 39.7 kb가 포함되어 있다 (Stüken and Jakobsen, 2010). 이 중 cyrJcyrA 유전자는 CYN의 생성능을 식별하는 유전자로 사용되어 왔으며, 특 히 황산기전달효소 (sultotransferase)를 암호화하는 cyrJ 유 전자가 독소 생성능이 있는 균주를 발견하는 가장 적합한 지표로서, 최근 연구까지 CYN 독소 생성능이 있는 균주 에서만 발견되어왔다 (Mihali et al., 2008; Mazmouz et al., 2010).

    세계적으로 Aphanizomenon의 속에는 18개 이상의 분 류군이 기재되어 있으며, 최근 형태학뿐만 아니라, 생태 학, 계통분류학 등의 다양한 접근법을 이용한 연구에 의 해 유전적 다양성과 생리생태학적 특징이 종 수준에 서 다양하게 밝혀지고 있다 (Rajaniemi et al., 2005a, b; Ballot et al., 2010b; Komárek, 2013; Zhang et al., 2015). 대표적으로, Aphanizomenon속의 기준종 (type species) 인 Aphanizomenon flos-aquae Ralfs ex Bornet et Flahault 1888은 19세기 말 이후 남세균 독소 (Cyanobacterial toxins)의 잠재적인 생산자로 빈번하게 보고되어왔다 (Gentile and Maloney, 1969; Alam et al., 1978; Mahmood and Carmichael, 1986). 그러나 기존 연구에 사용된 균주 들이 실제로는 형태적으로 유사한 Aphanizomenon gracile Lemmermann 1907 혹은 Cuspidothrix issatschenkoi (Usačev) Rajaniemi et al. 2005로 밝혀졌다 (Li et al., 2000, 2003; Preßel et al., 2009; Cirés et al., 2014). 이로 인해, Cirés and Ballot (2016)는 분리된 균주를 형태 및 계통 학적으로 동정하고, 단일 배양을 통하여 독소의 생성여 부와 그에 따른 유전학적 분석 과정이 검증되어야만 독 소 생성 분류군으로 정의될 수 있다는 의견을 제시하였 다. 이러한 과정을 통해 Aphanizomenon속의 분류군 중 Aphanizomenon gracileChrysosporum ovalisporum (Forti) E.Zapomelová, O.Skácelová, P.Pumann, R.Kopp & E.Janecek 2012, C. issatschenkoi가 독소 생성 분류군으로 확인되었으며 (Ballot et al., 2010a, b; Campo et al., 2013), 그 밖의 분류군은 독소 생성 분류군으로 확정 이전의 추정 상태로서 추가적인 연구가 진행되고 있다.

    수자원 관리 측면에서 Aphanizomenon속에 속하는 분 류군의 정확한 동정과 독소 생성능을 파악하는 것은 향 후 이 분류군에 의한 수화현상 및 출현빈도의 증가 가능 성을 고려할 때 필수적이라 할 수 있다 (Yamamoto and Nakahara, 2009). 따라서 본 연구의 목적은 낙동강의 보 구간을 중심으로 그 출현빈도와 횟수가 급증하고 있는 Aphanizomenon flos-aquae를 대상으로 (Yu et al., 2014; Park et al., 2015; Ryu et al., 2016), 16S rRNA 염기서열 을 이용하여 계통학적 위치를 확인하고, 남세균 독소인 saxitoxin (STX)과 cylindrospermopsin (CYN)의 잠재적 생 성능력을 유전자 수준에서 검토하고자 하였다.

    재료 및 방 법

    1.시료 채수 및 균주 분리

    현장시료는 Aphanizomenon속이 우점하여 출현한 2016 년 8월 낙동강 중하류 수역의 적포교 지점 (N 35°31′40. 88ʺ, E 128°21ʹ36.16ʺ)과 2016년 10월 삼랑진교 지점 (N 35°22ʹ55.61ʺ, E 128°49ʹ7.79ʺ)에서 표층수를 채수하여 이 용하였으며, 채수된 시료는 균주의 분리를 위하여 실험실 로 운반되었다. 현장시료 이외에 국립낙동강생물자원관 생 물자원은행에서 보관 중인 Aphanizomenon flos-aquae 2개 균주 (FBCC010006, FBCC010007)를 제공받았다.

    현장시료로부터 Aphanizomenon 균주를 분리하기 위해, 도립 현미경 (Leica DMi1, ×400) 하에서 파스퇴르 피펫을 사용하여 멸균된 CB 배지 (Shirai et al., 1989)가 담긴 well cell culture plate로 옮겨졌으며, 이 과정은 Aphanizomenon 의 single trichome이 분리될 때까지 반복하여 수행하였다. 분리된 균주는 150 ml 배지가 담긴 250 ml Erlenmeyer flask에 담아 진탕배양기 (Hanbaek, HB-201SLI)에서 다음 조건으로 배양되었다; 21℃의 온도, 80 μmol s-1 m-1의 백 열등 광조건 (L : D=12 h : 12 h). 배양된 균주는 광학현미 경 (Nikon ECLIPSE 80i)을 이용하여 정확한 동정을 실시 하고 사진촬영 하였으며, 촬영된 사진은 이미지 분석 프 로그램 (NIS-Elements F 3.0 software)을 통해 세포의 길이 와 크기를 분석하였다. 종의 형태적 분류는 Komárek and Komáková (2006)와 Komárek (2013)을 참고하였다.

    2.DNA 추출 및 PCR 증폭

    배양된 균주는 대수증식기 (exponential growth phase) 까지 유지되었으며, 원심분리하여 배양액과 균주를 분 리하여 실험에 사용하였다 (14,000×g, 1 min). DNA는 LaboPassTM Tissue Mini (Cosmogenetech, Korea)를 사용 하여 추출하였다.

    PCR 반응 용액의 조성은 1.0 μL의 DNA template, 3 μL의 10X TaKaRa Ex Taq buffer, 2.4 μL의 dNTP (10 mM), 0.5 μL 의 primer (10 pmol), 0.2 μL의 TaKaRa Ex Taq polymerase (5 Unit μL-1, TaKaRa, Ohtsu, Japan)로 구성하였으며, 전 체 용량이 30μL가 되도록 하였다. 16S rRNA는 primer PA (Edwards et al., 1989)와 B23S (Lepère et al., 2000)을 이용 하여 증폭하였으며 (Table 1), PCR 조건은 초기 변성단계인 94℃에서 5분간 1회 처리한 후 DNA 변성단계인 94℃에 서 30초, primer 풀림단계인 50℃에서 30초, strand 신장 단 계인 70℃에서 1분간 진행하여 총 30회 반복하였으며, 최 종 신장 단계는 72℃에서 3분간 처리하였다.

    3.16S rRNA의 염기서열 분석

    증폭된 16S rRNA의 PCR 산물은 Qiaquick PCR purification kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 정제하였다. 정 제된 PCR product는 PA, CYA359F (Nubel et al., 1997), pFr (Edwards et al., 1989), 16S1494R (Wilmotte et al., 2002)의 primer를 이용하여 sequencing reaction을 수행하 였으며, 염기서열 결정을 위해서 Macrogen (Seoul, Korea) 에 분석을 의뢰하였다.

    4.16S rRNA의 계통학적 분석

    계통학적 분석을 위하여 forward와 reverse 방향의 각 염기서열들은 Vector NTI Advance 11 (Invitrogen Corp., USA)로 조합하였다. 분류학적 위치를 확인하기 위하 여, 유전자은행 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 이용하여 1,000 bp 이상의 염기서열이 등 록된 분류군을 선별하였다. 정렬된 염기서열은 MEGA 5.2 (Tamura et al., 2011)를 이용하여 Maximum likelihood (ML)와 Maximum parsimony (MP), Neighbor-joining (NJ) 방법으로 계통수를 작성하였고, 염기치환 모델은 Tamura- Nei와 Subtree-prunning-regrafting (SPR) algorithm, Maximum composite Likelihood이 각각 사용되었다. 각 분계도 의 지지 정도를 알아보기 위해 1,000회 반복하여 bootstrap 을 산출하였다. Outgroup로는 Chroococcales에 속하는 Microcystis aeruginosa (Accession no.: AB035549)가 사용 되었다.

    5.목표유전자 (target gene)를 이용한 독소 생성능 (toxigenecity) 분석

    Saxitoxin 독소의 생합성을 암호화하는 sxt 유전자 cluster 는 최근 Aphanizomenon gracile strain NH5 뿐만 아니라, Dolichospermum circinale, Cylindrospermopsis raciborskii, Raphidiopsis brookii, Lyngbya wollei의 균주에서도 확 인된다 (Kellmann et al., 2008; Mihali et al., 2009, 2011; Stucken et al., 2010). Aph. gracile strain NH-5에서 saxi toxin 암호화 유전자 cluster의 크기는 약 27.5 kb로 구성 되어 있으며, 유전자 cluster는 26개 유전자로 구성되어 있 다 (Fig. 1a). Cylindrospermopsin 암호화 cyr 유전자 cluster 는 Aphanizomenon sp. 균주 10E6에서 분석되었으며, 총 11개의 cyr 유전자의 약 39.7 kb로 구성되어있다. cyr 유 전자 cluster는 3구역에 배치되어 있는데, 첫 번째 구역 은 aminidinotransferase, nonribosomal peptide/polyketide synthase, polyketide synthase를 각각 암호화하는 cyrA, cyrB, cyrE를 포함하며, 정방향으로 전사된다. 두 번째 구 역은 cyrC를 포함하며, 역방향으로 전사되고, 세 번째 구역 은 cyrD-cyrK를 포함한다 (Stuken and Jakobsen, 2010) (Fig. 1b).

    목표유전자 하나를 이용한 분석보다 두 가지 이상의 목 표유전자를 사용하는 방법은 완전한 유전자 cluster를 파악 하고, 균주가 가지고 있는 독소 생성능 유전자형 (toxigenic genotype)을 검증하는 데 보다 신뢰할 수 있는 결과를 도 출할 수 있다 (Kokociński et al., 2013). 본 연구에서는 독 소 생성능을 파악할 수 있는 목표유전자를 sxtA, sxtI, cyrA, cyrJ 등 총 4개를 선별하였으며, 목표유전자 증폭을 위한 primer의 경우 sxtA 유전자는 Ballot et al. (2010b)을, sxtI 유전자는 Casero et al. (2014), cyrA 유전자는 Stüken & Jakobsen (2010), cyrJ 유전자는 Mihali et al. (2008)을 각각 참고하여 설계하였다 (Table 1). PCR 증폭 조건은 sxtA가 94℃에서 4분간 처리한 후, 94℃ 10초, 55℃ 20초, 72℃ 1 분을 30회 반복한 뒤, 72℃에서 1분간 처리하였고, sxtI가 94℃에서 4분간 처리한 후, 94℃ 10초, 55℃ 20초, 72℃ 1 분을 30회 반복한 뒤, 72℃에서 3분간 처리하였으며, cyrA 는 95℃에서 5분간 처리한 후, 95℃ 30초, 62℃ 1분, 72℃ 1분을 40회 반복한 뒤, 72℃에서 7분간 처리하였다. cyrJ 유전자의 증폭조건은 94℃에서 3분간 처리한 후, 94℃ 10 초, 57℃ 20초, 72℃ 1분을 30회 반복한 뒤, 72℃에서 7분 간 처리하였다.

    결과 및 고 찰

    1.형태적 특징

    현장시료에서 분리된 균주의 자원 번호 (strain number) 는 DGUC001과 DGUC003으로, 국립낙동강생물자원관 생 물자원은행에서 제공한 균주의 자원 번호는 FBCC010006 과 FBCC010007로 각각 구분되었다 (Table 2).

    DGUC001과 DGUC003는 육안으로 관찰 가능한 크 기의 다발 (fascicles)을 형성하였으며, 세포사 (trichome) 가 병렬 형태로 나열되어 최대 길이가 1.5 cm까지 관찰 되었다 (Fig. 2a). 단일 세포사 (trichome)는 직선이거나 약 간 휘어진 형태이며, 아대칭 (subsymmetric) 구조를 가 지고 있었다. 영양 세포 (vegetative cell)는 원통형으로 4~12.1×3.6~5.6 μm이며, 세포사의 양쪽 끝에 위치한 말 단 세포 (terminal cell)는 최대 18.3 μm로 관찰되었으며, 거의 투명하거나 긴 끈 형태의 세포질이 존재하였다. 이 형세포 (heterocyte)는 단독으로 관찰되었으며, 원통형으 로 6.6~7.8×4.2~5.1 μm의 크기로 관찰되었다. 아키네트 (akinete)는 영양 세포 사이에 위치하고 있고, 긴 원통형 으로 30~62×5.2~7.5 μm이며, 컵 모양의 초 (cup-shaped sheath)를 형성하지 않았다 (Fig. 2b). 현장시료에서 분리한 DGUC001과 DGUC003은 다발의 형태, 말단 세포의 구조 등을 통하여 형태적으로 Aphanizomenon flos-aquae Ralfs ex Bornet et Flahault 1888로 동정되었다 (Komárek and Komáková, 2006; Komárek, 2013; Ryu et al., 2017).

    FBCC010006은 갈색을 띠고 있었으며, 육안으로 관 찰 가능한 매트 (mat)를 형성하였다. 세포사 (trichome) 는 탄력성 있게 휘어지는 형태로 나타났으며, 세포 격벽 (cross wall) 부분이 잘록하게 구분되었다. 술통 혹은 원통 형의 세포 (cell)로 3.8~4.2×4.0~4.4 μm의 크기의 등직 경이었다. 이형세포 (heterocyte)는 오직 세포사 (trichome) 의 양 쪽 말단의 위치하여 대칭 (symmetric) 구조를 이루 며, 끝이 둥근 원통형 또는 원뿔형 세포로 나타났다. 크기 는 6.2~7.9×4.1~5.0 μm에 해당하였다. 국립낙동강생물 자원관 생물자원은행에서 분양받은 Aphanizomenon flosaquae (FBCC010006)는 이형세포의 위치와 세포사의 구 조에 따른 형태적 분석결과, Cylindrospermum sp.로 동정 되었지만, 배양균주의 특성상 아키네트 (akinete)를 형성하 지 않아 정확한 종 수준의 동정은 불가하였다 (Komárek, 2013). FBCC010007은 청록색을 띠고 있으며, 넓고 얇 은 매트 (mat)를 형성하였다. 세포사 (trichome)가 일직 선 혹은 약간 구부러진 형태로 정단부분 (ends)에 가늘어 짐이 없었고, 격벽 (cross-wall)의 잘록함도 없었다. 또한, 운동성이 있어 현미경 관찰 중에 움직임이 보였다. 세포 는 2.3~9.8×1.0~2.9 μm의 크기로 매우 가늘고 길며, 세 포 격벽 부근에 과립 (granule)을 가지고 있었다 (Fig. 2c). 정단세포 (apical cell)는 둥글고, 때로 미세하게 구부러 졌다. 국립낙동강생물자원관 생물자원은행에서 분양받 은 Aphanizomenon flos-aquae (FBCC010007)는 세포사 의 형태, 과립 (granule)의 형성, 아키네트 (akinete) 및 이형 세포의 미발달 등에 따른 형태적 분석결과, Geitlerinema amphibium (C. Agardh ex Gomont) Anagnostidis 1989로 동 정되었다 (Komárek, 2013).

    2.염기서열 및 계통학적 특징

    낙동강 현장시료에서 분리된 균주의 16S rRNA를 정 렬하여 분석한 결과, 전체 구간의 길이는 DGUC001과 DGUC003이 각각 1,569와 1,541 bp로 획득되었으며, 획 득된 염기서열은 최종 1,303 bp로 정렬되었다. 염기 조성 의 평균은 A가 26.2%, T가 18.5%, G가 30.9%, C가 22.5% 였으며, DNA의 구조 및 물리적 특성을 결정하는 G+C 의 함량은 전체적으로 약 53.4%로 산출되었다. Kimura’s two parameter model을 이용한 각 분류군 간 유전적 거리 (Pairwise distance)는 Cluster I의 15개체 염기변이가 외군 을 포함하여 0~0.196으로 나타났고, 외군을 제외한 15개 체의 염기변이는 0~0.012로 낮게 나타났다.

    낙동강 현장시료에서 분리된 두 개의 균주는 98.4%의 유전적 유사도를 나타내어 계통분류학적으로 동일종으로 판단하였고, 유전자은행에서 선별한 Custer I의 Aphanizomenon flos-aquae에 대하여 98~99%의 유전적 유사도를 나타내었다. 16S rRNA를 이용한 종 분리의 유전적 유사도 임계값에 대한 최근 연구들에 따르면, 98% 수준을 기준으 로 제시하고 있다 (Kim et al., 2014). 따라서 낙동강 현장시 료에서 분리된 두 개의 균주는 계통분류학적으로 동일종 인 Aphanizomenon flos-aquae Ralfs ex Bornet et Flahault 1888로 동정되었다. 동정된 두 개 균주의 유전자 정보는 유전자은행 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA)에 등록되었으며, KY327795, KY327796의 Accession no.를 각각 부여받았다.

    16S rRNA를 이용한 유전자계통분석을 통해 Aphanizomenon속의 분류군은 크게 5개의 cluster로 구분되었으며, 이 중 cluster 1~3의 구분은 비교적 낮은 bootstrap value에 의해 지지되었다. cluster I과 III에는 형태학 및 계통학적 으로 검증된 Aphanizomenon flos-aquaeAphanizomenon gracile이 해당되었으나 (Cirés et al., 2014; Zhang et al., 2015), Cluster II는 분류가 불분명한 Aphanizomenon flosaquae/ gracile 혹은 Aphanizomenon sp.의 균주들이 주 로 포함되었다 (Cirés and Ballot, 2016). 전통적으로 두 종의 형태적 분류는 다발 (fascicle)의 형성과 아키네트 (akinete)의 부속지 (appendice) 존재가 중요한 분류형질 이 되지만 (Komárek, 2013), 물리적 교란에 의해 쉽게 분 리되는 다발 (fascicle)의 특성과 아키네트 (akinete)의 낮 은 형성율로 인해 분류가 쉽지 않은 것으로 알려져 있다 (Cirés and Ballot, 2016; Ryu et al., 2017). 이로 인하여 기 존에 Aphanizomenon flos-aquae로 보고된 일부 균주들은 Aphanizomenon gracile로 재분류되었거나 (Accession no.: AY196086) (Li et al., 2000, 2003), 재분류가 검토되고 있 다 (Accession no.: AF317632, HE975010, AJ293131) (Cirés and Ballot, 2016).

    한편, 낙동강생물자원관 생물자원은행에서 제공받은 Aphanizomenon flos-aquae (FBCC010006, FBCC010007) 균주의 16S rRNA를 정렬하여 분석한 결과, 전체 구간의 길이는 각각 1,500와 1,562 bp로 획득되었으며, 두 개의 균 주는 89%의 유전적 유사도를 나타내었다. FBCC010006 은 유전자은행의 BLAST 분석을 통해 Cylindrospermum속 의 분류군과 95~97%의 상동성을 보였고, 계통분석에서 도 90~93%의 bootstrap value로 Cylindrospermum cluster 로의 분지가 지지되었다. FBCC010007은 Geitlerinema속 의 분류군과 97~98%의 상동성을 보였고, 계통분석에서도 99~100%의 bootstrap value로 지지되었다 (Fig. 3).

    3.잠재적 독소 생성능 (toxigenecity) 분석

    독소 생성 분류군의 정의는 분리된 균주에 의해 동정되 어야 하고, 단일배양에 따른 독소 유무와 유전적 검토 확 인이 필수적이다 (Cirés and Ballot, 2016). 이러한 개념에 의해 정의된 Aphanizomenon flos-aquae의 독소 생성능은 아직 논쟁의 여지가 있다 (Table 3).

    낙동강에서 분리된 균주들의 세포독소 (cylindrospermopsin) 와 신경독소 (saxitoxin)의 잠재적 독소 생성능 을 확인하기 위하여 사용된 독소 생합성 유전자 중, cylindrospermopsin 생합성에 관여하는 cyrAcyrJ 유 전자는 어떠한 조건에서도 증폭이 되지 않았다. 한편, saxitoxin 생합성에 관여하는 유전자 중 sxtA는 DGUC001 와 DGUC003에서 각각 534 bp와 524 bp로 증폭되었으며, 522 bp로 정렬되었다 (Table 4). 정렬된 목표유전자 (target gene)의 염기서열을 NCBI 유전자은행에서 BLAST한 결 과, Aphanizomenon flos-aquae (Accession no.: FN552399) 및 Aphanizomenon gracile (Accession no.: JN837670, FN552392)의 sxtA 유전자와 100%의 상동성을 보여 sxtA 유전자가 DGUC001과 DGUC003에서 증폭되었음을 최종 적으로 확인하였다. 한편, 독소 생성여부를 결정하는 분자 생물학적 지표로서 사용된 sxtI 유전자는 어떠한 조건에서 도 증폭되지 않았다. 이를 통하여 낙동강에서 분리된 균주 들은 cylindrospermopsin과 saxitoxin의 생합성 여부를 결 정하는 목표유전자 (target gene)인 sxtI, cyrJ를 가지고 있지 않은 것으로 확인되었다.

    saxitoxin 생합성 과정에서 가장 먼저 발현되는 sxtA 유 전자는 Aphanizomenon spp.에서 독소 생합성 유전자로 가 장 광범위하게 조사되었으며, PSP 독소 생성 균주뿐만 아 니라, 모든 비독성 분류군 (Aphanizomenon gracile, Aphanizomenon flos-aquae, Cuspidothrix issatschenkoi, Chrysosporum ovalisporum, Sphaerospermopsis aphanizomenoides) 의 균주에서도 발견되었다. 이러한 발견으로 인하여 saxitoxin 생성 균주를 확인하기 위한 분자생물학적 지표로 서 sxtA 유전자는 사용될 수 없었으나 (Ballot et al., 2010b; Ledreux et al., 2010), sxtA 유전자의 존재를 통하여 수계 내에서 독소 생성 균주와 독소 비생성 균주의 공존 가능성 을 추정할 수 있었다 (Moustafa et al., 2009). 전체 sxt 유전 자 집단 중 sxtl 유전자를 제외한 sxtA, sxtG, sxtH, sxtX 유 전자들은 독소 비생성 균주인 Aphanizomenon flos-aquae strain NIVA-CYA 689와 Aphanizomenon gracile NH-5에서 도 동일하게 발견되었다 (Ballot et al., 2010b; Casero et al., 2014; Cires et al., 2014). 이러한 발견은 sxtl 유전자만이 saxitoxin을 생성하는 Aphanizomenon spp.를 검출할 수 있 는 특이적인 지표로서 사용될 수 있음을 의미하였다.

    미국 Klamath 호는 Aphanizomenon flos-aquae에 의한 녹조현상이 빈번하게 발생하는 수역으로, 신경독소 물질의 검출은 한 번도 보고되지 않았다 (Carmichael et al., 2000). 또한 독일 Sechlin호에서 분리된 Aphanizomenon flosaquae의 균주를 이용한 독소 생성능 분석 실험에서는 해 당 균주 (Accession no.: FN552398, FN552399, FN552400, FN552401)들이 cylindrospermopsin과 saxitoxin, anatoxin- a의 독소물질을 생성하지 않는 비독성 균주로 확인되 었다 (Ballot et al., 2010b). 최근 본 연구팀은 낙동강 수계 에서 출현하는 Aphanizoenon flos-aquae 분리 균주의 독소 생성성을 ELISA 방법을 통해 확인하였으며, 그 결과 다양 한 환경조건에서 성장된 조체와 배양액에서 saxitoxin과 cylindrospermopsin이 생성되지 않음을 확인하였다 (미발 표 자료). 따라서 Aphanizomenon flos-aquae의 독소 생성 능 및 독소 분류군으로의 분류는 보다 면밀하고 추가적인 검토가 필요할 것으로 판단되었다.

    적 요

    독소 생성 분류군의 정의는 분리균주에 의해서 동정되 고, 단일배양에 의한 독소 생성 여부 및 유전적 검토가 확 인된 분류군을 의미한다. 이러한 관점에서 Aphanizomenon flos-aquae의 독소 생성능은 세계적으로 아직 논쟁의 여 지가 있다. 본 연구는 낙동강에서 분리한 Aphanizomenon flos-aquae (DGUC001, DGUC003)을 대상으로 16S rRNA 염기서열을 이용하여 계통학적 위치를 확인하고, 남세균 독소인 saxitoxin (STX)과 cylindrospermopsin (CYN)의 잠 재적 생성능력을 유전자 수준에서 검토하였다. 연구에 사용 된 균주는 2016년 8월과 2016년 10월에 낙동강 본류구간의 하천수에서 분리되었다. 계통학적 분석에는 16S rRNA가 사용되었으며, 독소 생성 유전자는 CYN과 STX 생합성에 관여하는 cyrA, cyrJ, sxtA, sxtI 유전자가 선택되었다. 분리 된 균주 DGUC001과 DGUC003은 육안으로 관찰 가능한 크기의 다발 (fascicles)을 형성하였으며, 세포사 (trichome) 가 병렬 형태로 나열되고, 세포사의 양쪽 끝에 위치한 말 단 세포 (terminal cell)가 거의 투명하거나 긴 끈 형태의 세 포질을 가지고 있었다. 또한, 두 개의 균주는 98.4%의 유 전적 유사도를 나타내어 동일종으로 판단되었고, 유전자 은행에서 선별한 Cluster I의 Aph. flos-aquae strains과도 계통수에서 66~82%의 bootstrap value의 지지도로 단일 cluster에 포함되었다. 확보된 두 개 균주의 유전자 정보는 유전자은행 NCBI에 등록되었으며, KY327795, KY327796 의 Accession no.를 부여받았다. 한편, 세포독소 CYN의 생합성에 관여하는 유전자 cyrAcyrJ는 두 개 균주 모 두에서 확인되지 않았다. STX의 생합성을 담당하는 유전 자 중 sxtA 유전자는 두 개의 균주에서 확보되었으며, 독소 생합성 과정의 분자생물학적 지표 역할을 하는 sxtI 유전 자는 발견되지 않았다. 따라서 낙동강 현장시료에서 분리 된 두 개의 균주는 형태학적 및 계통분류학적으로 동일종 인 Aphanizomenon flos-aquae Ralfs ex Bornet et Flahault 1888로 동정되었으며, 두 개의 균주는 CYN과 STX의 잠 재적인 독소 비생성 균주로 확인되었다. 이 결과를 통하여 Aph. flos-aquae가 독소 생성 분류군으로 분류되는 것에 대 한 보다 면밀한 검토가 필요할 것으로 판단되었다.

    사 사

    본 연구는 2014학년도 대구대학교 연구비 지원에 의해 수행되었습니다.

    Figure

    KSL-50-137_F1.gif

    (a) Saxitoxin biosynthesis (sxt gene) cluster of Aphanizomenon sp. strain NH-5 (after Mihali et al., 2009). (b) cylindrospermopsin biosynthesis (cyr gene) cluster of Aphanizomenon sp. strain 10E6 (after Stüken and Jakobsen, 2010). Puatetive enzyme functions are included.

    KSL-50-137_F2.gif

    Photographs of strains isolated in Nakdong River (a, b) and offered from Nakdonggang National Institute of Biological Resources (c, d); (a) fascicles of Aphanizomenon flos-aquae, (b) trichome of Aphanizomenon flos-aquae, (c) trichome of Cylindrospermum sp. (d) filaments of Geitlerinema amphibium.

    KSL-50-137_F3.gif

    Phylogenetic relationships of Aphanizomenon spp. inferred using Maximum likelihood, Maximum parsimony and Neighbor-joining analysis. The tree was based on Maximum likelihood tree. The analysis was based on partial 16S rRNA sequences. Strains of this study are marked bold. Scale bar indicates 2% sequence divergence. PSP+(CYN+) and PSP-(CYN- ) denote PSP (CYN)-toxin producing and non-producing strains, respectively. sxtA+ denotes strains in which sxtA gene has been amplified.

    Table

    List of primers to amplify partial sxt and cyr genes, 16S.

    Diacritical morphological characteristics of four strains isolated in Nakdong River or offered from Nakdonggang National Institute of Biological Resources.

    Characteristic of cyanotoxins produced by Aphanizomenon spp. strains. Modified from Cirés et al., 2014.

    Only the production confirmed in isolated strains is included. The symbol ‘?’ stands for toxin-producing strains whose species identification remains unclear.
    1anatoxin-a-producing Aphanizomenon sp. (strain 3) (Rapala et al., 1993)
    2cylindrospermopsin-producing Aphanizomenon sp. (flos-aquae/gracile) (Preussel et al., 2006; St ken et al., 2009; Preussel et al., 2014)
    3paralytic shellfish poisoning toxin-producing Aphanizomenon flos-aquae/Aphanizomenon sp. NH-5 (Mahmood and Carmichael, 1986) reclassified as Aph. gracile by subsequent studies (Li et al., 2000)
    4Sphaerospermopsis aphanizomenoides for which only morphological but not phylogenetic data are available (Sabour et al., 2005). The symbol X stands for isolated strains in which target genes has been not amplified from this study. Abbreviations: AFAQ: Aphanizomenon flos-aquae, AGRC: Aphanizomenon gracile, CISA: Cuspidothrix issatschenkoi, SAPH: Sphaerospermopsis aphanizomenoides; PSP: paralytic shellfish poisoning.

    DNA sequences of saxitoxin biosynthesizing gene (sxtA) in Aphanizomenon flos-aquae isolated from Nakdong River. Sequence direction is 5ʹ to 3ʹ.

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