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ISSN : 2288-1115(Print)
ISSN : 2288-1123(Online)
Korean Journal of Ecology and Environment Vol.46 No.2 pp.301-309
DOI : https://doi.org/10.11614/KSL.2013.46.2.301

북한강 수계 조류대발생 원인종 남조 Anabaena의 분자계통학적 검토

이 준, 한명수, 황수옥1, 변명섭2, 황순진3, 김백호*
(한양대학교 생명과학과, 1한국수자원공사, 2한강물환경연구소, 3건국대학교 환경과학과)

Molecular Identification of the Bloom-forming Cyanobacterium Anabaena from North Han River System in Summer 2012

Baik-Ho Kim*, Zhun LI, Myung-Soo Han, Su-Ok Hwang1, Myeong-Seop Byeon2, Soon-Jin Hwang3
Department of Life Science, Hanyang University, Seoul 133-791, Korea
1K-waters, Korea Water Resources Corporation, Gwacheon, Gyeonggi 427-100, Korea

2Han River Environment Research Center, National Institute of Environmental Research, Gyeonggi 427-100, Korea
3Department of Environmental Science, Konkuk University, Seoul 143-701, Korea
(Manuscript received 1 April 2013, Revised 14 May 2013 Revision accepted 19 June 2013)

Abstract

Between May and August 2012, a massive cyanobacterial bloom with Anabaena hasbeen occurred throughout the North Han River. Sampling was conducted at onestation on each lake, L. Uham, L. Cheongpyung, and L. Paldang, where occurred adense bloom, in 13 July. According to the microscopic examination, the blooms wasdominated by one specific filamentous cyanobacterium Anabaena and other phytoplankton.Morphologically, previous literature proven that this Anabaena species isA. crassa (Lemmermann) Komark.-Legn. & Cronberg. However, identification ofspecies in a mixed population is complicated due to limited morphological differences.Therefore, with live sample including trichome, akinete and heterocyst, the sequencesof 16S rRNA gene of Anabaena isolates were cloned and analyzed, and three 16SrRNA gene sequences of 1188~1520 bp in length were obtained. It was shown fromthe homologous analysis results that the obtained 16S rRNA sequences were highlyhomologous to the relevant sequences of A. crassa in GenBank. The 16S rRNA sequencesof 63 species were retrieved from GenBank, and the phylogenetic tree wasconstructed by using these sequences.

16-북한강(1321)(생태).184652.pdf405.6KB

서 론

 일반적으로 자연수에서 흙이나 곰팡이 냄새를 일으키는 화학물질(2-MIB과 Geosmin)은 주로 방선균, 조류, 이들 상호작용을 거쳐 발생하며 이들의 농도 또한 특정 조류종이나 밀도, 그리고 박테리아와 상호관계에 따라 차이를 보이기 때문에 냄새유발 조류에 대한 관심이 증가하고 있다(Lim et al., 2006). 특히 남조류 대발생을 일으키는 대표적인 속의 하나인 Anabaena의 geosmin생성에 대한 연구는 활발하게 진행되어 왔다(Izaguirre et al., 1982; Hayes and Burch, 1989; Saadoun et al., 2001; Wang et al., 2005).

 우리나라는 총 인구의 약 40%가 서울-경기 수도권에 집중되어 있으며, 이들의 음용수 공급은 주로 한강수계(북한강, 남한강, 경안천)에 절대적으로 의존하고 있다. 한강수계는 지난 2012년 여름철 동안 하천과 호소에 상관없이 Anabaena가 대발생하였고 동반된 맛과 냄새발생으로 인하여 음용수 공급과 관련된 민원이 급증하였다(http://www.hani.co.kr/arti/society/environment/545937.html).

 한강수계에서 Anabaena 대발생은 매우 이례적으로 지금까지 보고된 사례는 전무하다 (Jung et al., 2004; Kim et al., 2004; Kwon et al., 2006; Lee and Choi, 2012; You et al., 2013). 다만 소양호에서 Anabaena macrospora (Cho et al., 1989), Anabaena spp. (Lee et al., 1998) 대발생, 북한강 수계에서 냄새발생을 일으키는 Anabaena spiroides의 성장특성 연구(Lee et al., 2013), 한강에서 냄새 발생 식물플랑크톤 연구 (Lee and Choi, 2012) 등이 보고된 바 있으나 이들의 분류학적 연구는 진행되지 않았다.

 국외에서는 브라질의 몇몇 저수지에서 Anabaena 대발생을 보였으며 맛이나 냄새보다 독소 Anatoxin-a량도 급증하여 음용수 공급에 문제를 일으켰다 (Frizzo et al., 2004; Yunes et al., 2005; Becker et al., 2008). 한편, Anabaena flos-aquae (Mahmood et al., 1988; Cook et al., 1989), Anabaena lemmermannii (Henriksen et al., 1997) 등도대발생을 일으켰으며 Rio Grande do Sul (Monserrat et al., 2001; Yunes et al., 2003)과 Pernambuco (Molica et al., 2005)에서는 Anabaena crassa와 A. spiroides가 동시에 대발생하였고, Zapomˇelová et al. (2008)에서는 Anabaena crassa와 A. circinalis가 혼재하였다. 일반적으로 남조 Anabaena의 동정은 영양세포의 형태적 특성만으로는 정확한 동정이 어렵기 때문에 16S rRNA 염기분석법을 이용하며(Lee et al., 1996) 이들의 생리, 생태학적 특성을 이해하는데도 유용하다. Nübel et al. (1997)은 남조류 16S rRNA에서 세균 (eubacteria)에서는 존재하지 않는 독특한 유전자 부위를 보고하고 무균배양이나 cloning없이 남조류 영양세포로부터 직접 16S rRNA 염기서열 분석을 통하여 종 동정을 시도하였다.

 결국 Anabaena 대발생을 일으킨 현장에서는 형태적으로 유사한 종들이 혼재 (co-existence)하는 경우가 많아 반드시 형태 및 분자생물학적 분석이 동시에 이루어져야한다 (Werner and Laughinghouse, 2009; Becker et al., 2010; Zapomˇelová et al., 2008). 본 연구는 2012년 여름철 북한강수계에서 대발생을 일으킨 남조 Anabaena의 분류학적 특성을 파악하기 위하여 3개 호소(의암호, 청평호, 팔당호)에서 직접 분리한 Anabaena 영양세포(이형세포 및 휴면포자)의 형태 및 분자계통학적 분석을 시도하고 16S rRNA 염기서열을 근거로 분리주(isolates)들간의 유연관계를 조사하였다.

재료 및 방법

1. 시료채집 및 분석

 시료채집은 남조 Anabaena 대발생 기간중 가장 높은 밀도를 보였던 2012년 7월 13일에 북한강 수계 3개 호수 - 의암호 (H2), 청평호 (H3), 팔당호 (H7)에서 시료채집이 용이한 정점을 1개씩을 선정하여 실시하였다(Fig. 1).

Fig. 1. A map showing the sample collection site. Lake Uam (H2), Lake Cheongpyung (H3) and Lake Paldang (H7). A photo in right-bottom is the scene of Anabaena bloom in Han River System between May and August 2012.

생시료의 세포관찰을 위하여 각 정점의 표층수를 채수하여 250 mL 폴리에틸렌 병에 넣어 실험실로 운반하였다. 한편 세포밀도를 파악하기 위하여 채수된 시료를 Lugol’s solution으로 고정하여(최종농도 0.5%) 균일하게 섞은 다음 실험실로 운반하였다. 세포관찰 및 계수는 광학현미경(Zeiss axioplan, ×1,000)하에서 실시하였으며, 고정시료 1mL를 Sedgwick-Rafter counting chamber에 장착하여 시료당 최소 300세포 이상 계수하여 산정하였다. 조류동정은 선행연구문헌을 참고하였다 (Willame et al., 2006; Komárek and Zapomˇelová, 2007; Werner and Laughinghouse, 2009; Tuji and Niiyama, 2010; Zapomˇelová et al., 2012). 

 남조 Anabaena의 분자생물학적 분석을 위하여 각 정점의 표층수를 Van-Dorn 채수기로 채수한 다음 2L 플라스틱통에 넣고 암상태를 유지하여 실험실로 운반한 다음 곧바로 genomic DNA 추출 및 PCR을 실시하였다.

2. Genomic DNA 추출

 남조 Anabaena의 genomic DNA는 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 추출하였고, 방법은 다음과 같다. 세포 조체에 Buffer AP1 (lysis buffer) 400 μL와 RNase A (100 mg mL-1) 4 μL를 첨가한 후 65℃에서 10분간 배양하였다. 그 후 Buffer AP2 (precipitation buffer) 130 μL를 첨가한 후 얼음에서 10분간 다시 배양하였다. 침전물을 제거하기 위해 QIAshredder spin column에 lysate를 넣고 5분 후에 14,000 rpm에서 2분간 원심분리하였다. Column을 통과한 여과액을 세포 잔해들을 취하지 않도록 하여 새로운 1.5 mL tube로 옮기고, 1.5배 부피의 Buffer AP3/E (binding buffer)를 첨가한 후 조심스럽게 pipette을 이용하여 혼합하였다. 혼합물 중 650 μL를 취하여 DNeasy mini spin column에 넣고 막에 잘 흡수되도록 5분간 상온에 방치한 다음 12,000 rpm에서 1분간 원심분리하고 column 막에 DNA가 부착되도록 하였다. 이어 여과액을 제거한 후 남아 있는 혼합물을 취하여 동일한 방법으로 다시 원심분리 하였다. 새로운 collection tube에 DNeasy column을 놓고 Buffer AW (wash buffer) 500 μL를 첨가한 후 막의 흡수를 위해 2분간 상온에서 방치한 후, 12,000 rpm에서 원심분리하고 여과액을 제거하였다. Buffer AW 500 μL를 다시 column에 첨가하여 동일한 방법으로 세척하였는데, 이때에는 막이 완전히 마를 수 있도록 14,000 rpm에서 2분간 원심분리 하였다. DNeasy column을 새로운 1.5 mL tube에 옮긴 후, 예열 (65℃)되어 있던 Buffer AE (elution buffer) 100 μL를 취하여 막의 중앙부위에 천천히 떨어뜨렸다. 용액이 막에 잘 스며들 수 있도록 약 5분간 방치한 다음 12,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 최종 DNA를 얻었다.

3. PCR 반응

 PCR reaction은 50 μL를 최종 부피로 하여 수행하였다. Genomic DNA 2 μL, 100 pmol CYAN108F (ACGGGTGAGTAACRCGTRA) (Urbach et al., 1992) 3 μL, 100 pmol 16SCYR (CTTCAYGYAGGCGAGTTGCAGC) (Urbach et al., 1992) 3 μL, 10 mM dNTP mix 4 μL, dH2O 13 μL)과 master mix 2 (Pwo DNA polymerase (5 U μL-1) 0.5 μL, 10×PCR buffer with 20 mM MgSO4 5 μL, dH2O 19.5 μL)를 각각 제조하여 reaction 이전에 가볍게 섞어주고 다음 조건에서 수행하였다: DNA template의 초기 denaturation은 94℃에서 4분간 일어나고, 그 후 denaturarion 과정은 94℃에서 15초, annealing과정은 55℃에서 30초, elongation 과정은 72℃에서 45초 동안 반복된 조건에서 PTC-100 Programmable Thermal Controller (MJ Research, Inc., USA)를 사용하여 40회 증폭하였는데, 마지막으로 72℃에서 7분 동안 extension reaction을 수행하였다. PCR 산물들은 Trisacetate-EDTA buffer (pH=8.3±0.1, FisherBiotech, USA)를 사용한 1.0% agarose gel (BMA, USA)에서 전기영동하여(100 V, 20분), 각 PCR 산물의 크기와 성공도를 확인하였다 (Mupid 21, Cosma Bio Co., Japan).

4. DNA sequencing

 정제된 PCR product clone들의 DNA sequencing은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 AutoDNA sequencer에 의해 수행되었다(Bionex, Korea).

5. 남조 Anabaena속의 분자계통학적 분석

 상기 실험에서 얻은 Anabaena의 염기서열을 이용하여 본 연구에서는 이 종의 계통학적 위치를 확인하였다. 염기서열 비교를 위해서 계통수에 사용된 염기서열은 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 획득하여 이용하였다(Table 1). 외군 (out-group)으로는 군체형 남조 (Synechococcus sp. PCC 7117, S. elongates 6301)를 이용하였다. 염기서열의 편집은 BioEdit 프로그랩(v. 7.1.3; Hall, 1999)을 이용하였으며, 정열은 CLUSTAL W for Mac (Thomson et al., 1994)을 이용하였다. 염기서열 자료를 통한 계통학적 유연관계 분석에서 근린결합분석(Neighbor-joining analysis)은 PAUP (Phylogenetic Analysis Using Parsimony, ver. 4.0; Swofford, 2002)를 사용하였으며, 최대유사분석(Maximun-likelihood analysis)은 PhyML (Guindon and Gascuel, 2003)을 각각 이용하였다. 최대유사분석에서 계통수의 각 branch의 신뢰도는 1000회의 bootstrap을 이용하였다.

Table 1. Strain number, isolation locality and GenBank number for species used in the molecular phylogenetic analysis.

Table 1. Continued.

결과 및 고찰

1. 남조 Anabaena의 형태

 영양세포는 구형이거나 반달형이며, 세포직경은 10~13 μm, heterocyst는 투명하고 구형이며 12 μm, akinete는 계란형으로 15×25 μm이다. 나선형 필라멘트 (trichome)는 1 cycle의 폭은 30~75 μm이며, 길이는 30~65 μm로 가로와 세로가 비슷하다. 조류대발생 기간 동안 필라멘트는 규칙적으로 회전하며, 종종 느슨하게 신장되어 부드러운 직선형도 동시에 관찰된다(Fig. 2). 형태적으로 유사한 종들의 형태적 특성을 비교하였다 (Table 2). Komárek and Zapomˇelová (2007)는 형태적으로 차이를 보인 coiled Anabaena 종들의 16S rRNA 염기서열만으로 비교하기 어렵고, 그 중 A. spiroides와 A. flos-aquae는 특히 형태적으로도 구분하기 어렵다고 보고하였다. 한편 Anabaena 속은 영양세포가 직선형(straight)과 코일형(coiled)이 섞인 종들은 크기가 비교적 큰 것으로 A. planctonica, A. crassa, A. circinalis, A. mucosa 등이 있으며, 작은 종으로는 A. flos-aquae, A. lemmermanii 등이 있으며, strain인 A. sigmoidea 항상 이질적(두 가지 타입이 동시에 존재하기 때문에)이므로 Anabaena 종 동정은 결국 wild type과 strain type에 대한 형태 및 분자적 연구가 동시에 이루어져야 한다고 주장하였다. 이번 조사에서 출현한 Anabaena의 형태학적 특성은 선행문헌에 따르면 Anabaena crassa (Lemmermann) Komark.-Legn. & Cronberg와 가장 높은 유사성을 나타냈다 (Komárek and Zapomˇelová, 2007; Zapomˇelová et al. 2008). 다만 분자생물학적 분석결과 또 다른 종인 A. circinalis와는 사실상 형태적으로 구분하기 어려웠으며 이는 Zapomˇelová et al. (2008, 2012)의 견해와 일치하였다. 따라서 한강수계의 다양한 분리주의 형태적 특성 및 분자생물학적 연구가 추가적으로 이루어져야 할 것으로 판단된다.

Fig. 2. Photos of toxic cyanobacterium Anabaena crassa (Lemmermann) Komark.-Legn. & Cronberg in Han River System (sites H2, H3, and H7) between May and August, 2012. 1. Coiled trichome of A. crassa collected during the bloom period, Han River System 2012 (×100). 2. Straight-type trichome of A. crassa (×400). V; vegetative cells, A; akinete, H; heterocyst.

Table 2. Morphological comparisons among Anabaena (A) with similar phenotypes (Komárek and Zapomˇ elová, 2007).

2. 남조 Anabaena의 염기서열

 남조 Anabaena의 분자생물학적 특성을 조사하기 위하여 현장에서 분리한 Anabaena로부터 16S rRNA를 직접 추출하는 방법을 이용하여 염기서열을 비교 분석하였다.

 본 조사에서 확인된 남조 Anabaena의 의 16S rRNA 유전자부위 염기서열을 분석한 결과, 사용된 Anabaena 속에 대한 16S rRNA 염기의 길이가 가장 긴 종은 Anabaena spiroides NIES-77 2478 bp의 염기를 가지고 있었고, 가장 짧은 종은 Anabaena spiroides NIES-76으로 646 bp의 염기를 가지고 있었다. 두 Anabaena (H-7)과 Anabaena (H-2)의 염기서열은 서로 100% 유사도를 나타내 동일종으로 판단하였고 이들은 모두 Anabaena crassa TAC strains에 대하여 99~100% 유사도를 보여 북한강 수계의 시료를 Anabaena crassa 종으로 처리하였다 (Fig. 3). 한편 Anabaena (H-3)의 경우는 열기서열은 Anabaena circinalis TAC strains에 높은 유사도(100%)를 보여 Anabaena circinalis로 나타났다. Zapomˇelová et al. (2008, 2012)는 A. crassa와 A. circinalis는 유전적으로는 구분이 거의 되지 않으며 strain과 환경조건에 따라 영양세포, 이형세포, 휴면포자 등의 형태적 차이를 보인다고 하였다. 본 연구에서 H3는 H2와 H7 사이에 위치하며 거리상 10km 이내로 매우 가깝기 때문에 현 시점에서 북한강 수계에서 대발생을 일으킨 남조 Anabaena는 A. crassa로 처리하여도 크게 문제되지 않을 것으로 판단되었다.

Fig. 3. Phylogenetic relationships of Anabaena taxa inferred by maximum likelihood analyses settings obtained using Modeltest (Posada & Crandall 1998). The analysis was based on partial 16S rRNA sequences (908 bp). Two Synechococcus species were used as an outgroup for the purpose of rooting the analyses. In maximum likelihood analyses the best - ln likelihood score was 3233.5317 using the TrN+I+G model (Tamura and Nei, 1993). Only bootstrap values of 50% or higher are shown to the left of internal nodes. The first numbers are from maximum likelihood analyses (100 replications) and the second numbers are from neighbor-joining analyses (1000 replications).

3. 유연관계

 근린결합분석 (Neighbor-joining analysis)결과는 최대 유사분석(Maximun-likelihood analysis) 결과와 통일하게 나타났다. 최대절약분석결과, 66개 분류군에서 얻어진 16S rRNA 염기서열에서 계통수의 길이는 909였으며, 최대절약계통수는 1개로 나타났다. 분석결과 Anabaena (H-7) 및 Anabaena (H-2) 명확하게 주로 Anabaena crassa 포함된 Anabaena crassa Group에 속하였다. 한편 Anabaena (H-3)는 주로 Anabaena circinalis 포함된 Group에 속한 반면, 기존에 한강수계에 분포한다고 알려진 Anabaena spiroides는 다양하게 분산되어 정확한 Grouping이 되지 않았다(Fig. 3).

 결과를 종합하면 한강수계에서 조류대발생을 일으킨 남조 Anabaena는 의암호 (H2), 청평호 (H3), 팔당호 (H7) 모두 동일종 Anabaena crassa (Lemmermann) Komark.-Legn. & Cronberg일 가능성이 높으며, 이 종과 형태 및 분자계통학적으로 거의 일치한 A. circinalis는 환경요인에 따라 형태변이가 쉽게 일어나는 그룹으로 밝혀졌다.

사 사

 본 연구는 2012년도 한강수계 환경기초조사사업의 일환으로 수행되었으며 시료채집에 도움을 주신 박명환, 조인환, 김하경, 변정환 군에게 감사드립니다.

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