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ISSN : 2288-1115(Print)
ISSN : 2288-1123(Online)
Korean Journal of Ecology and Environment Vol.47 No.4 pp.350-357
DOI : https://doi.org/10.11614/KSL.2014.47.4.350

The Calculation Method of Cell Count for the Bloom-forming (Green tide) Cyanobacterium using Correlation between Colony Area and Cell Number in Korea

Kyung-A You*, Mi-Ae Song1, Myeong- Seop Byeon1, Hae-Jin Lee2, Soon-Jin Hwang3
Han River Environment Research Center, National Institute of Environmental Research, Gyeonggi-do 476-823, Korea
1Water Environment Research Department, National Institute of Environmental Research, Incheon 404-708, Korea
2Nakdong River Environment Research Center, National Institute of Environmental Research, Gyeongsangbuk-do 717-873, Korea
3Department of Environmental Health Science, Konkuk University, Seoul 143-701, Korea
Corresponding Author : Tel: +82-31-770-7274, Fax: +82-31-773-2268, angelka@korea.kr
November 20, 2014 December 24, 2014 December 26, 2014

Abstract

Harmful Algal Bloom Alert System (HABAS) for drinking water supply is require to fast and accurate count as system monitoring of cyanobacterium occurrence and inducing a response action. We measured correlation between colony size and cell number including genus Anabaena, Aphanizomenon, Microcystis, Oscillatoria which are targeted at HABAS, deducted from standard formula, and suggested calculation method from colony size to the number of cell. We collected cyanobacteria samples at Han River (Paldang reservoir), Nakdong River (Dalseong weir, Changnyeonghaman weir) and Geum River (Gobok reservoir) from August to October, 2013. Also, we studied correlation between colony size and cell number, and calculated regression equation. As a result of correlation of harmful cyanobacteria by genus, Anabaena spp. and Aphanizomenon spp. having trichome showed high correlation coefficients more than 0.93 and Microcystis spp. having colony showed correlation coefficient of 0.76. As a result of correlation of harmful cyanobacteria by species, Anabaena crassa, Aphanizomenonflos-aquae, A. issatschenkoi, Oscillatoria curviceps, O. mougeotii having trichome showed high correlation coefficients from 0.89 to 0.96, and Microcystis aeruginosa, M. wessenbergii, M. viridis having colony showed correlation coefficients from 0.76 to 0.88. Compared with other genus Microcystis relatively showed low correlation because even species and colony size are the same, cell density and cell size are different from Microcystis strains. In this study, using calculated regression might be fast and simple method of cell counting. From now on, we need to secure additional samples, and make a decision to study about other species.


군체 크기와 세포수 상관관계를 이용한 녹조 유발 남조류의 세포수 산정 방법

유 경아*, 송 미애1, 변 명섭1, 이 혜진2, 황 순진3
국립환경과학원 한강물환경연구소
1국립환경과학원 물환경연구부
2국립환경과학원 낙동강물환경연구소
3건국대학교 보건환경과학과

초록


    서 론

    최근 들어 우리나라 하천이나 호수에서 남조류 과다 증식에 의한 녹조 현상이 빈번하게 발생하고 있다. 녹조 (image_1.tif潮, green tide) 현상이란 수중의 식물플랑크톤이 대량 으로 증식하여 수체가 녹색 또는 남색을 띄는 것을 말하 는데, 우리나라 수계의 수질은 질소와 인이 풍부하기 때 문에 적당한 온도와 빛만 있으면 자연스럽게 조류가 증 식하고, 여기에 수온이 상승하고 체류시간이 길어지면 남조류가 기하급수적으로 증가한다(You et al., 2013). 전 세계적으로 나타나고 있는 기후변화는 수온 증가와 더 불어 강우 패턴의 변화로 예측되고 있으며 이는 결국 유 해 남조류 대발생 또는 빈도의 증가를 야기시킨다(Elke and Ghadouani, 2012).

    상수원 호수에서 남조류 과다증식은 심미적 또는 생태 적 문제와 더불어, 수처리 공정에서의 여과지 폐쇄, 맛· 냄새 물질 생성, 남조류 독소 문제 등 먹는물 공급에서 부터 건강 위해성까지 여러 가지 문제점을 유발할 수 있 다(Watson, 2004; van Apeldoorn et al., 2007; Watson et al., 2007; You et al., 2013).

    이에 따라 정부에서는 1998년부터 상수원 주요 호소 에 대하여 조류 발생상황을 신속히 물관리 기관에 전파 하여 조류 발생으로 인한 피해를 최소화하고 조류 독소 로부터 먹는물의 안전성을 확보하고자 조류경보제를 시 행하고 있으며, 2013년에는 낙동강 보 구간에도 확대 시 범운영하고 있다. 조류경보제의 발령 기준은 클로로필 a 농도와 유해 남조류 세포수로 발령 단계에 따른 기준치 (주의보 500 cells mL-1, 경보 5,000 cells mL-1, 대발생 1,000,000 cells mL-1)가 설정되어 있는데, 조류 발생 정 도에 따른 발령 단계를 즉각적으로 발령하고 대응하기 위해서는 남조류 세포를 신속하고 정확하게 계수하는 것이 무엇보다 중요하다(NIER, 2013).

    그러나 남조류는 단일세포의 크기가 매우 작고 이러한 세포가 모여 구형 또는 사상형을 이루며 점액질에 둘러 싸여 부정형의 군체(colony 또는 trichome)를 형성하기 때문에 정량분석을 위한 각각의 세포 계수는 많은 시간 과 노력이 소요된다. Anabaena, Oscillatoria와 같은 사 상체의 경우 사상체의 수를 세거나 사상체의 길이를 이 용하여 간접적으로 세포수를 계산하는 방법을 사용하기 도 하나(Ahn et al., 2007), Microcystis 군체의 경우 보통 수천 개의 세포로 구성되어 있어 이를 계수하기 위해 작 은 군체 또는 각각의 세포로 분해시키는 추가적인 과정 이 필요하다(Lawton et al., 1999). 따라서 군체를 형성하 는 남조류의 세포 계수는 분석자의 숙련도 또는 주관에 따라 상당한 차이가 나타날 수 있기 때문에 전통적인 세 포 계수법을 대체할 더 간단하고 객관적인 방법이 필요 하다(Ahn et al., 2007).

    Joung et al. (2006)Microcystis sp.를 대상으로 군체 크기와 세포수 간의 상관관계를 이용하여 군체 형성 남 조류 계수에 대한 연구를 수행하였으며, 이 연구를 참고 하여 Zhou et al. (2012)Microcystis (M. flos-aquae, M. aeruginosa, M. wessenbergii) 종에 대한 연구를 수행 하였다. 두 연구는 Microcystis 속만을 대상으로 하였으 며 군체의 형태를 구형으로 간주하여 길이를 측정해 부 피로 환산하는 방법을 사용하였다.

    본 연구에서는 조류경보제 발령기준 대상 남조류인 Anabaena, Aphanizomenon, Microcystis, Oscillatoria 속 을 대상으로 세포수 산정방법 연구를 수행하였다. 구형 또는 부정형의 Microcystis 속은 면적을 측정하고 사상형 의 Anabaena, Aphanizomenon, Oscillatoria 속은 길이를 측정하여 종별 군체 크기와 세포수 간의 상관관계를 조 사하였고, 종 및 속 별 회귀식을 도출하여 신속 정확한 남조류 세포수 계수의 기초자료로 활용하고자 하였다.

    재료 및 방법

    1.조사시기 및 지점

    본 연구는 2013년 8월~10월까지 녹조가 발생한 시기 에 한강 수계의 팔당호와 경안천(st.1), 금강 수계의 고 복저수지(st.2), 낙동강 수계의 달성보(st.3)와 창녕함안 보(st.4)에서 남조류 시료를 채집하였다(Fig. 1, Table 1). Anabaena 속은 한강 수계에서 7월 10일, 10월 10일, Aphanizomenon 속은 낙동강 수계에서 8월 1일, 9월 5~ 13일, Microcystis 속은 한강 수계에서 7월 10일, 낙동강 수계에서 9월 5일, 고복저수지에서 9월 21일, Oscillatoria 속은 한강 수계에서 7월 10일, 낙동강 수계에서 9월 5일 에 채집하였다.

    2.분석방법

    남조류 시료는 플랑크톤 네트(mesh size; 20 μm)를 사 용하여 채집하였으며, 검경을 위해 채집한 시료에 lugol’s 용액을 넣어 최종농도 1~2%로 고정하였다. 1 mL의 Sedgwick-Rafter Chamber 또는 슬라이드 글라스를 이용 하여 200~1,000배 하의 위상차현미경(Carl Zeiss, Microscope Axio Imager A2, Germany)으로 동정 및 계수하 였고, 남조류의 동정은 한국담수조류도감(Chung, 1993), 영국담수조류도감(John et al., 2002; 2011), 일본담수조류 도감(Hirose, 1977) 등을 참고하였다. 조류경보제 발령 기준 대상 남조류인 Anabaena, Aphanizomenon, Microcystis, Oscillatoria 속에 대해 Anabaena 1종, Aphanizomenon 2종, Microcystis 3종, Oscillatoria 2종의 군체 길이와 면적을 현미경프로그램 ZEN software 2011을 이 용하여 측정하였다(Fig. 2). Microcystis의 경우 대부분 모양이 불규칙하고(John et al., 2011) 여러 군체가 붙어 있는 경우가 많기 때문에 원형으로 간주하기에 어려움 이 있어 면적을 측정하는 방법을 사용하였다(NIER, 2009).

    결과 및 고찰

    1.남조류 Microcystis의 군체 면적과 세포수 상관관계

    조류경보제 발령 기준 대상 남조류 중 유일하게 구형 에 가까운 Microcystis 속의 여러 종 중 국내 수계에서 흔하게 출현하는 M. aeruginosa (n=91), M. wessenbergii (n=30), M. viridis (n=6)를 대상으로 군체 면적과 세포 수를 측정하였다. Microcystis 종별 군체 면적 및 세포수 간의 상관분석 결과, M. aeruginosa의 r2 값은 0.761, M. wessenbergii의 r2 값은 0.824 였으며, M. viridis의 r2 값 은 0.887로 높은 상관성을 보였다(Fig. 3). 이는 NIER (2009)의 연구에서 M. aeruginosa (r2=0.828, n=250)와 M. wesenbergii의 결과(r2=0.849, n=209)와 유사하였다. 군체 면적과 세포수 상관식의 기울기는 M. wesenbergii (0.012)가 M. aeruginosa (0.348)보다 적게 나타났는데, M. wesenbergii의 세포 크기가 M. aeruginosa보다 더 크 며 점액질 내의 세포가 덜 조밀하게 구성되어 있기 때문 으로 판단된다(NIER, 2009). Microcystis 군체의 부피를 이용하여 분석한 Zhou et al. (2012)의 연구에서도 M. aeruginosa (r2=0.742, n=61), M. wessenbergii (r2=0.760, n=63)의 결과가 본 연구와 유사하게 군체 크기와 세포 수의 상관성이 높은 것으로 조사되었다(Table 2). 상관 분석을 이용하여 회귀식을 도출해 낸 결과는 다음과 같 으며, Y는 군체 1개당 세포수, X는 측정한 군체 면적을 나타낸다.

    Y=0.035X-2.594 (Microcystis aeruginosa)

    Y=0.012X-42.862 (Microcystis viridis)

    Y=0.012X-0.468 (Microcystis wessenbergii)

    2.사상형 남조류의 군체 길이와 세포수 상관관계

    조류경보제 발령 기준 대상 남조류 중 사상형 남조류 인 Anabaena 속, Aphanizomenon 속, Oscillatoria 속의 여러 종 중 국내 수계에서 출현 빈도가 높은 Anabaena crassa (n=97), Aphanizomenon flosaquae (n=112), A. issatschenkoi (n=75), Oscillatoria curviceps (n=9), O. mougeotii (n=101)를 대상으로 군체 길이와 세포수를 측정하였다. 사상형 남조류의 종별 군체 길이와 세포수 간의 상관분석 결과 A. crassa의 r2값은 0.946, A. flos- aquae의 r2값은 0.897, A. issatschenkoi의 r2값은 0.893, O. curviceps의 r2값은 0.909, O. mougeotii의 r2값은 0.962로 나타나 매우 높은 상관성을 보였다(Fig. 4). NIER (2009)의 연구결과에서도 Aphanizomenon flosaquae (r2=0.932, n=94), Anabaena spp. (r2=0.962~ 0.981, n=316), Oscillatoria limosa (r2=0.842, n=144)가 본 연구와 유사하게 매우 높은 상관성을 나타냈다(Table 3). 상관분석을 이용하여 회귀식을 도출해 낸 결과는 다 음과 같으며, Y는 사상체 1개당 세포수, X는 측정한 사 상체 길이를 나타낸다.

    Y=0.120X-6.221 (Anabaena crassa)

    Y=0.178X+0.568 (Aphanizomenon flosaquae)

    Y=0.180X-1.643 (Aphanizomenon issatschenkoi)

    Y=0.381X-7.368 (Oscillatoria curviceps)

    Y=0.466X+5.634 (Oscillatoria mougeotii)

    본 연구에서는 현미경의 프로그램을 사용하여 남조류 의 불규칙한 면적 또는 곡선 등의 길이를 직접적으로 측 정하였다(Fig. 2). 그러나 이러한 software 사용이 불가능 한 경우에는 사상형 남조류의 경우 종에 따라 곡선으로 휘어지는 등의 다양한 형태를 갖기 때문에 현미경상 직 접적으로 사상체의 길이를 측정하는 것은 어렵다(Walsby and Avery, 1996). 이에 따라 Olson의 사상형 남조류 길 이 측정법(Olson, 1950)이 개발되어 자연 상태(Gibson, 1975; Booker and Walsby, 1981; Oliver and Walsby, 1984)와 배양 상태(Konopka et al., 1978; Konopka, 1982) 에서의 사상형 남조류에 대한 길이 측정법으로 사용되 었으며, 이후에는 컴퓨터 이미지 프로그램을 이용하여 자동으로 분석하는 방법이 고안되기도 하였다(Walsby and Avery, 1996). 이러한 기존의 연구 방법을 적용한다 면 software 대안으로 사상형 남조류의 길이 측정도 가 능할 것으로 보인다.

    3.조류경보제 발령 단계별 남조류 군체수 산정

    앞서 분석한대로 군체 크기와 세포수의 상관성이 남 조류 속별로 종간 차이가 크지 않기 때문에 속 단위로 묶어 상관분석을 하였다. Microcystis 속(n=127)의 상관 분석 결과 r2값은 0.765, Apanizomenon 속(n=187)의 r2 값은 0.931, Oscillatoria 속(n=111)의 r2값은 0.911로 나타났으며, Anabaena 속은 A. crassa 단일 종만 조사되 어 제외하였다(Figs. 4, 5). 사상형 남조류가 구형 남조류 보다 상관성이 더 높았는데 이는 본 연구와 동일한 방법 으로 사상형(r2=0.84~0.98)과 구형(r2=0.83~0.85) 남 조류를 조사한 연구 결과나 Microcystis를 대상으로 군 체 면적 대신 부피를 이용하여 세포수와의 상관분석을 한 연구 결과(r2=0.73~0.81)와도 일치하였다(Joung et al., 2006; NIER, 2009; Zhou et al., 2012). Microcystis 속 의 군체 면적과 세포수 간 상관성이 사상형 남조류보다 낮은 이유는 동일한 종, 동일한 크기의 군체라도 Microcystis strain에 따라 점액질 내의 세포 밀집 정도와 세포 크기에 차이가 있기 때문이다(Chen et al., 2009). 군체 크기와 세포수 상관관계는 남조류 종과 속 간에 큰 차이 를 보이지 않았기 때문에 속 단위로 구분하여 회귀식을 도출하였다.

    Y=0.011X+72 (Microcystis spp.)

    Y=0.452X+5 (Oscillatoria spp.)

    Y=0.188X-1 (Aphanizomenon spp.)

    본 연구를 통해 도출된 회귀식을 이용하여 각각의 군 체 면적(또는 길이)을 측정하고 세포수로 환산하는 방법 이 정확할 수 있으나, 우선적으로 분석용 software가 없 으면 측정이 불가능하고 또한 불규칙적인 군체 면적 또 는 곡선의 사상체 길이를 측정하는 것 역시 세포수 계수 만큼 많은 시간이 소요될 수 있다. 따라서 조류경보제 발령 단계별 세포수 기준에 맞춰 군체수를 산정하였다 (Table 4). 이는 불규칙적인 군체를 형성하는 Microcystis 속과 세포 사이 격막의 구분이 명확하지 않은 Oscillatoria 속, Aphanizomenon 속의 세포 계수가 어렵고 분석 자 간의 편차가 클 수 있기 때문에 세포수 대신 군체수 로 대체하여 계수할 수 있도록 제시하였다.

    호주 (Hötzel and Croome, 1999)와 핀란드 (Finish Environment institute, 2003) 등 남조류 대발생이 빈번하 여 이를 관리하고 있는 나라에서는 구형 또는 사상형의 군체를 형성하는 남조류 계수 시에 종별 군체당 평균 세 포수를 조사, 총 세포수로 환산하는 방법을 이용하여 군 체를 계수하고 있다. 또한 군체가 큰 경우에는 군체 일부 의 세포를 계수한 뒤 전체 군체 크기를 예측하는 방법도 제시하고 있다. 국내에서도 조류경보제 발령 기준으로 유해 남조류 세포수를 제시하고 있기 때문에 남조류의 군체당 세포수 산출방법에 대한 연구를 통해 합리적인 남조류 계수법 제시가 필요하다고 하겠다(NIER, 2008). 이를 위해서는 본 연구 결과와 더불어 국내 수계에 출현 하는 남조류의 종별 군체 크기, 군체당 세포수에 대한 조사 연구가 많이 수행되어 표준화된 값의 도출이 우선 되어야 할 것이다.

    적 요

    국내 상수원을 대상으로 시행하고 있는 조류경보제는 남조류 발생 현황을 취·정수장 등 물관리 기관에 전파 하여 대응조치를 유도하는 제도로 신속하고 정확한 남 조류 계수를 필요로 한다. 따라서 조류경보제 발령 기준 대상 남조류인 Anabaena, Aphanizomenon, Microcystis, Oscillatoria 속의 군체 크기와 세포수의 상관관계를 조 사하고 회귀식을 도출하여 군체 크기로 세포수를 계산 할 수 있는 방법을 알아보고자 하였다. 2013년 8월부터 10월까지 남조류가 과다증식한 시기에 한강(팔당호), 낙 동강(달성보, 창녕함안보) 및 금강(고복저수지)의 대표지 점에서 남조류 시료를 채집하였으며, 조류경보제 발령 기준 대상 남조류 속의 종별 군체 크기와 세포수의 상관 관계를 조사하여 종 및 속별 회귀식을 산정하였다. 남조 류의 속별 상관분석 결과는 사상형인 AnabaenaAphanizomenon의 r2값이 0.93 이상으로 높은 상관성을 보였으며 구형의 Microcystis는 0.76의 상관계수 값을 나타냈다. 종 별 상관분석 결과 사상형 남조류 Anabaena crassa, Aphanizomenon flos-aquae, A. issatschenkoi, Oscillatoria curviceps, O. mougeotii는 r2값이 0.89~ 0.96의 범위로 높은 상관성을 나타냈으며, 구형인 Microcystis aeruginosa, M. wessenbergii, M. viridis는 0.76~ 0.88의 상관계수 값을 나타냈다. 다른 속에 비해 상대적 으로 Microcystis의 상관성이 낮게 나타난 이유는 동일 한 종, 동일한 크기의 군체라도 Microcystis strain에 따 라 점액질 내의 세포 밀집 정도와 세포 크기에 차이가 있기 때문이다. 본 연구 결과 도출한 회귀식을 이용하여 군체 크기 측정값을 세포수로 환산하는 방법이 기존의 세포 계수법과 비교할 때 신속하고 간편할 것으로 보인 다. 향후 남조류 종별 더 정확한 회귀식을 도출하기 위 해서는 많은 시료수 확보와 더불어 다른 종들에 대한 조사 연구가 진행되어야 할 것이다.

    Figure

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    The map showing the sampling sites.

    KSL-47-350_F2.gif

    Microscopic photographs for measurement of harmful cyanobacteria size using ZEN software 2011. (a) Anabaena crassa, (b) Apha- nizomenon flos-aquae, (c) Microcystis wesenbergii, (d) Oscillatoria mougeotii.

    KSL-47-350_F3.gif

    Regression equation between colony area and cell number of colonial cyanobacteria (Microcystis spp.).

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    Regression equation between trichome length and cell number of filamentous cyanobacteria (Anabaena spp., Aphanizomenon spp., Oscillatoria spp.).

    KSL-47-350_F5.gif

    Regression equation between colony area (or trichome length) and cell number in genus of harmful cyanobacteria.

    Table

    Location of the sampling sites from August to October, 2013.

    This study and reference about correlation between colony area (or volume) and cell number of Microcystis spp. (x: colony size (μm2), y: cell number).

    This study and reference about correlation between trichome length and cell number of Anabaena spp., Aphanizomenon spp. And Oscillatoria spp. (x: trichome length (μm), y: cell number).

    The calculation of cyanobacterial colony (or trichome) numbers by HABAS (harmful algal bloom alert system).

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